10013.5 真菌/酵母细胞线粒体内膜功能/膜电位荧光测定试剂盒产品说明书 主要用途 真菌/酵母细胞线粒体内膜功能/膜电位荧光测定试剂是一种旨在通过高度敏感的阳离子荧光羰花青染料结合到线粒体基质，其荧光的增强或减弱说明线粒体膜电位的变化，即内膜电负性的增高或降低，来分析线粒体内膜功能的完整性的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种实验用真菌/酵母菌株细胞线粒体内膜功能/膜电位检测。可以被用于细胞凋亡、信号传递、衰老等的研究。产品严格无菌，即到即用，活体检测，操作简易，性能稳定。 技术背景 真菌/酵母细胞是一种低等单细胞真核生物，具有细胞生长快，易于培养，遗传操作简单明了等原核生物的特点。作为模式生物，它具有比较完备的基因表达调控机制和表达产物的加工修饰能力，在分子遗传学方面认识早，作为外源基因表达的细胞宿主。阳离子荧光羰花青染色剂JC-1（5,5',6,6'-tetrachloro- 1,1',3,3'-tetraethylbenzimidazolcarbocyanine iodide）是一种对膜电位高度敏感的染色剂。它特异性地进入线粒体，分布和结合在线粒体基质上。线粒体膜电位的高低变化决定了JC-1的分布浓度。电位高，JC-1形成聚集体，而浓度高，荧光显色为红色或桔红色；反之，则为绿色。荧光减弱表明线粒体内膜功能受到损害。 产品内容 清理液（Reagent A） 80毫升 染色液（Reagent B） 100微升 平衡液（Reagent C） 20毫升 产品说明书 1份 保存方式 保存染色液（Reagent B）在－20℃冰箱里，严格避免光照；其余的保存在4℃冰箱里，有效保证6月 用户自备 1.5毫升离心管：用于真菌/酵母染色的容器 载玻片：用于染色观察 微型台式离心机：用于样品操作 培养箱或恒温水槽：用于染色孵育 比色皿或96孔板：用于荧光定量分析的容器 （共聚焦）荧光显微镜：用于细胞荧光分析 细胞流式仪：用于细胞荧光分析 荧光分光光度仪或荧光酶标仪：用于细胞荧光定量分析 实验步骤 实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的染色液（Reagent B）置入冰槽里融化，平衡液（Reagent C）放进28℃恒温水槽里预热。然后移出10微升染色液（Reagent B）到新的1.5毫升离心管，加入990微升平衡液（Reagent C），混匀后，在冰槽里静置，并标记为染色工作液，放在暗室里。然后进行下列操作。 1．准备好1毫升新鲜的酵母菌液（OD600＝1至2；1 X 107细胞/毫升） 2．移入到1.5毫升离心管 3．放进微型台式离心机离心10分钟，速度为1000g（或3000RPM，例如eppendorf 5415） 4．小心抽掉上清液 5．加入1毫升预冷的清理液（Reagent A），混匀 6．放进微型台式离心机离心10分钟，速度为1000g（或3000RPM，例如eppendorf 5415） 7．小心抽掉上清液 8．重复实验步骤5至7一次 9．加入500微升含有染色液（Reagent B）和平衡液（Reagent C）的染色工作液，混匀（注意：参见注意事项7） 10．放进28℃培养箱里或恒温水槽孵育20分钟，避免光照 11．放进微型台式离心机离心10分钟，速度为1000g（或3000RPM，例如eppendorf 5415） 12．小心抽掉上清液 13．加入1毫升预冷的清理液（Reagent A），混匀 14．放进微型台式离心机离心10分钟，速度为1000g（或3000RPM，例如eppendorf 5415） 15．小心抽掉上清液 16．加入500微升预冷的清理液（Reagent A），混匀 17．放进冰槽里 18．选择下列方式之一进行操作： 选择一、（共聚焦）荧光显微镜观察 1．混匀后，移出50微升在载玻片上 2．即刻进行载玻片压片，在荧光显微镜下进行观察（单滤波或双滤波）： 观察红色荧光：滤波器激发波长490nm，散发波长590nm或罗丹明（rhodamine）滤波器激发波长540nm， 散发波长570nm或德州红（Texas Red）滤波器激发波长590nm，散发波长610nm――可见 亮红色荧光；如果强度显著减弱，表明线粒体膜电位受到破坏 观察绿色荧光：滤波器激发波长490nm，散发波长530nm或荧光素（Fluorescein）滤波器激发波长490nm， 散发波长520nm――如果绿色荧光强度显著增强，表明线粒体膜电位受到破坏，未结合JC －1染料在细胞浆里 选择二、细胞流式仪分析 1.混匀后，即刻进行细胞流式仪双通道分析：观察50000个细胞以上 激发波长 488nm 488nm 匹配荧光染料 异硫氰酸荧光素（FITC） 藻红蛋白（phycoerythrin；PE） 荧光颜色 绿色 红色 散发波长 530 575 流式仪通道 FL1 FL2 荧光增强 膜损伤 膜电位正常 选择三、荧光分光光度仪或荧光酶标仪测定 1．混匀后，移出100微升到黑色96孔板里或100微升比色杯里 2．即刻放进荧光分光光度仪或荧光酶标仪测定（单一测定或双重测定）： 单一测定：激发波长490nm，散发波长590nm，获得相对荧光单位（RFU）：RFU值高表明线粒体膜电位正常 双重测定：激发波长490nm，散发波长590nm，获得红色荧光单位 激发波长490nm，散发波长530nm，获得绿色荧光单位――红色荧光单位除以绿色荧光单位终获得荧光比值：比值高表明线粒体膜电位正常 注意事项 1．本产品为20次（0.5毫升工作液）操作 2．操作时，须戴手套 3．操作时，避免污染母液 4．待测细胞建议不要过于饥饿或过度生长 5．建议细胞染色完成后，即刻进行荧光检测分析 6．孵育时，避免光照 7．根据不同菌株类型，可以调整染色工作液的使用剂量，避免过度染色 8．双滤波或双重测定：健康细胞和线粒体呈现红色；死亡或凋亡细胞及损伤线粒体呈现绿色 9．本公司提供缬氨霉素溶液（12042），作为线粒体内膜破坏分子，观察荧光显著减弱现象 10．细胞流式仪检测参考图像如下 （A）正常膜电位： （B）损伤膜电位： 11．荧光显微镜参考图像 12．本公司提供系列线粒体试剂产品 质量标准 1．本产品经鉴定性能稳定 2．本产品经鉴定荧光清晰 |
