HL10277.1 v.A

细胞骨架（肌动蛋白微丝；F-ACTIN）绿色荧光染色试剂盒产品说明书

主要用途

细胞骨架（肌动蛋白微丝；F-ACTIN）绿色荧光染色试剂是一种旨在使用异硫氰酸荧光素标记的鬼笔环肽（phalloidin），探寻细胞骨架的丝状肌动蛋白的分布和局部定向变化状况的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。主要适用于各种活体细胞（动物、人体、植物等）的细胞骨架装配的检测。产品严格无菌，即到即用，反应敏感，操作简捷，性能稳定。

技术背景

肌动蛋白（actin）是42KD的球蛋白，构成细胞骨架的微丝（microfilament）和肌肉收缩装置的细肌丝（thin filament），以及细胞膜表面伪足（pseudopodia）和微绒毛（microvilli）。肌动蛋白存在于所有真核生物细胞中，且高度进化保留，参与各种重要细胞功能，包括细胞迁移、细胞分裂、肌肉收缩、细胞形态维护、膜转运（membrane trafficking） 等。哺乳动物具有六种异构体，分成α、β、γ三类。球状肌动蛋白（G-actin）在生理条件下，组合成长丝聚合体，转化为丝状肌动蛋白（F-actin），形成细胞骨架的微丝。肌动蛋白的聚合与解聚的动态学变化是细胞骨架装配（cytoskeleton assembly）的主要参数之一。鬼笔环肽（phalloidin）是一种由毒性菇类中分离的二环七肽（bicyclic heptapeptide）生物碱，与聚合的微丝（F-肌动蛋白）结合，因此通过异硫氰酸荧光素（FITC）标记的鬼笔环肽可以体外探测细胞F-肌动蛋白的分布和含量，据此分析细胞骨架装配的调控机制。

产品内容

清理液（Reagent A）        毫升

固着液（Reagent B）        毫升

通透液（Reagent C）        毫升

封阻液（Reagent D）        毫升

染色液（Reagent E）      微升

复染液（Reagent F）       微升

产品说明书   1份

保存方式

保存染色液（Reagent E）和复染液（Reagent F）在－20℃冰箱里，避免反复冻融；其余的保存在4℃冰箱里，避免光照；有效保证6月

用户自备

胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（12024）：用于细胞脱离

*细胞培养液（12052）：用于中和胰蛋白酶的处理

15毫升锥形离心管：用于样品操作的容器

1.5毫升离心管：用于细胞染色的容器

（微型）台式离心机：用于样品操作

荧光（共聚焦）显微镜：用于细胞荧光观察

实验步骤

实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂置于室温下冻融。移取xx微升通透液（Reagent C）到1.5毫升离心管，然后分别加入xx微升染色液（Reagent E）和复染液（Reagent F），混匀后，标记为染色工作液，置于冰槽里，放进暗室里备用。然后进行下列操作。

• 直接法

• 准备1个细胞培养6孔板，内置1个细胞1 X 1 cm大小的载玻片
• 接种待测细胞培养，直至每孔铺满率达70％ 
• 小心抽去细胞培养液
• 轻轻加上xx微升清理液（Reagent A）到细胞载玻片上，覆盖样品表面
• 小心抽去清理液（Reagent A）
• 轻轻加上xx微升固着液（Reagent B）到细胞载玻片上，覆盖样品表面
• 置于冰槽里孵育30分钟
• 小心抽去固着液（Reagent B）
• 轻轻加上xx微升通透液（Reagent C）到细胞载玻片上，覆盖样品表面
• 小心抽去通透液（Reagent C）
• 轻轻加上xx微升封阻液（Reagent D）到细胞载玻片上，覆盖样品表面
• 室温下孵育30分钟
• 小心抽去封阻液（Reagent D）
• 轻轻加上xx微升清理液（Reagent A）到细胞载玻片上，覆盖样品表面
• 小心抽去清理液（Reagent A）
• 重复实验步骤14和15一次
• 小心加上xx微升染色工作液， 覆盖样品表面
• 在暗室里室温下孵育60分钟
• 小心抽去染色工作液
• 轻轻加上xx微升清理液（Reagent A）到细胞载玻片上，覆盖样品表面
• 小心抽去清理液（Reagent A）
• 封片
• 即刻在荧光（共聚焦）显微镜下进行观察（每个视野计数200个细胞）：激发波长488nm，散发波长530nm（F－肌动蛋白染色）或激发波长350nm，散发波长460nm（细胞核染色）――

绿色荧光显示F-肌动蛋白；蓝色荧光显示细胞核为圆环或椭圆状

• 间接法

• 准备1个25cm²细胞培养瓶的待测细胞，直至铺满率达70％（约100万细胞数）
• 小心移出细胞培养液到15毫升锥形离心管（收集悬浮细胞）
• 加入xx毫升清理液（Reagent A），覆盖细胞表面
• 小心移出xx毫升清理液（Reagent A）到15毫升锥形离心管 
• 加入1毫升用户自备的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，铺满细胞表面
• 放进37℃培养箱孵育1分种
• 轻轻手击震动培养瓶，使细胞脱落
• 加入3毫升用户自备的*细胞培养液
• 移入到15毫升锥形离心管（注意：悬浮细胞可以由此步开始）
• 放进台式离心机离心5分钟，速度为300g
• 小心抽去上清液
• 加入xx微升清理液（Reagent A），混匀
• 转入到1.5毫升离心管
• 放进微型台式离心机离心5分钟，速度为300g（或1500RPM，例如EPPENDORF 5415）
• 小心抽去上清液
• 加入xx微升固着液（Reagent B），混匀
• 置于冰槽里孵育30分钟
• 放进微型台式离心机离心5分钟，速度为300g（或1500RPM，例如EPPENDORF 5415）
• 小心抽去上清液
• 加入xx微升通透液（Reagent C），混匀
• 放进微型台式离心机离心5分钟，速度为300g（或1500RPM，例如EPPENDORF 5415）
• 小心抽去上清液
• 加入xx微升封阻液（Reagent D），混匀
• 室温下孵育30分钟
• 放进微型台式离心机离心5分钟，速度为300g（或1500RPM，例如EPPENDORF 5415）
• 小心抽去上清液
• 加入xx微升清理液（Reagent A），混匀
• 放进微型台式离心机离心5分钟，速度为300g（或1500RPM，例如EPPENDORF 5415）
• 小心抽去上清液
• 加入xx微升染色工作液
• 用200微升枪头上下轻柔抽吸，混匀细胞颗粒群
• 在暗室里室温下孵育60分钟 
• 放进微型台式离心机离心5分钟，速度为300g（或1500RPM，例如EPPENDORF 5415）
• 小心抽去上清液
• 加入xx微升清理液（Reagent A），混匀
• 放进微型台式离心机离心5分钟，速度为300g（或1500RPM，例如EPPENDORF 5415）
• 小心抽去上清液
• 加入200微升清理液（Reagent A），混匀
• 即刻移取10微升在载玻片上压片
• 在荧光（共聚焦）显微镜下进行观察（每个视野计数200个细胞）：激发波长488nm，散发波长530nm（F-肌动蛋白染色）或激发波长350nm，散发波长460nm（细胞核染色）――

绿色荧光显示F-肌动蛋白；蓝色荧光显示细胞核为圆环或椭圆状射

注意事项

• 本产品为10次操作
• 在整个操作过程中须戴手套，以防污染
• 孵育时，必须避免光照
• 建议检测细胞量达10⁶细胞数为佳
• 用户可以根据情况，适度调整试剂用量
• 建议细胞染色完成后，即刻进行荧光分析，不宜超过1小时 
• 注意：紫杉醇（PACLITAXEL），使F-肌动蛋白含量增加，荧光增强
• 本公司提供系列细胞骨架检测试剂产品

质量标准

• 本产品经鉴定性能稳定
• 本产品经鉴定荧光清晰