细菌蛋白酶（PROTEASE）活性比色法定量检测试剂盒

产品说明书

主要用途

细菌蛋白酶（PROTEASE）活性比色法定量检测试剂是一种旨在通过底物偶氮酪蛋白受到蛋白酶水解，产生橘红色产物的吸光峰值的变化，即采用比色法来测定样品中酶活性的而经典的技术方法。该技术经过精心改良、成功实验证明的。其适用于各种细菌细胞裂解液以及培养上清样品蛋白酶的总活性检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。

技术背景

蛋白酶（protease）又称为肽酶（peptidase）或蛋白质酶（proteinase），是一类蛋白水解的酶，属于水解酶（hydrolase）家属中一员，存在于所有生物体内。通过肽键的水解，进行蛋白质的分解代谢，参与体内血液凝结、补体系统、凋亡、细胞生长和分化等一系列生理活动。蛋白酶基本分成6类，包括丝氨酸（serine）、苏氨酸（threonine）、半胱氨酸（cysteine）、谷氨酸（glutamate）、天冬氨酸（aspartate）、金属（metalloprotease）蛋白酶等；也可以分成酸性、中性和碱性蛋白酶等；还可以分成内切肽酶，例如胰蛋白酶（trypsin），和外切肽酶，例如羧基肽酶A（carboxypeptidase）。细菌蛋白酶与碳和氮循环有关；作为外毒素（exotoxin），也是细菌致病的毒力（virulence）因子；同时细菌蛋白酶可以应用于食品、制药、皮革、诊断、水处理、银回收和洁净剂工业等。 同时据此用以识别革蓝氏阴性细菌，例如枯草芽孢杆菌（Bac. Subtilis）等。基于底物偶氮酪蛋白（azocasein或sulfanilamide azocasein），在细菌蛋白酶的催化水解下，产生橘红色产物，通过其吸收峰值的变化（440nm波长），来定量分析蛋白酶的总活性。其反应系统为：

产品内容

保存方式

保存反应液（Reagent B）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里；终止液（Reagent C）和中和液（Reagent D）具有腐蚀性，注意操作安全；有效保证6月

用户自备

1.5毫升离心管：用于样品操作的容器

微型台式离心机：用于样品制备

恒温水槽：用于孵育反应

比色皿：用于比色的容器

分光光度仪：用于比色分析

实验步骤

• 样品准备

• 准备好500微升待测细菌（OD600＝0.4至0.8，即1至2 X 10⁷细胞/毫升）
• 转移到到1.5毫升离心管
• 放进4℃微型台式离心机离心5分钟，速度为1000g（或3500RPM，例如EPPENDORF 5415）
• 小心抽去上清液
• 加入xx微升 裂解液（Reagent A），充分混匀
• 强力涡旋震荡15秒
• 置于冰槽里15分钟
• 放进4℃微型台式离心机离心15分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管
• 移取10微升进行蛋白定量检测
• 即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作

• 测定准备

• 准备好待测样品（例如细菌裂解萃取液或培养上清等），置于冰槽里
• 设定好分光光度仪（温度为37℃）：波长440nm，并置零

三、背景测定

• 移取xx微升 反应液（Reagent B）到新的1.5毫升离心管
• 加入xx微升 阴性液（Reagent E）
• 上下倾倒数次，混匀
• 在37℃温度下孵育30分钟
• 加入xx微升 终止液（Reagent C）
• 涡旋震荡5秒
• 在冰槽里孵育15分钟
• 即刻放进4℃微型台式离心机离心15分钟，速度为3000g 
• 小心移取500微升上清液到新的1.5毫升离心管
• 加入xx微升 中和液（Reagent D），混匀
• 转移到比色皿里
• 即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照

• 样品活性测定

• 移取xx微升 反应液（Reagent B）到新的1.5毫升离心管
• 加入100微升待测样品（蛋白总量100微克）（注意：样品需澄清）
• 上下倾倒数次，混匀
• 在37℃温度下孵育30分钟
• 加入xx微升 终止液（Reagent C）
• 涡旋震荡5秒
• 在冰槽里孵育15分钟
• 即刻放进4℃微型台式离心机离心15分钟，速度为3000g 
• 小心移取500微升上清液到新的1.5毫升离心管
• 加入xx微升 中和液（Reagent D），混匀
• 转移到比色皿里
• 即刻放进分光光度仪检测，此为样品读数

• 计算样品活性

注意事项

• 本产品为20次操作
• 操作时，须戴手套
•  终止液（Reagent C）和 中和液（Reagent D）具有腐蚀性，注意操作安全
• 系统检测时，背景测定只需一次
• 样品须澄清，至关重要
• 比色测定后，比色皿须清洗*
• 建议待测样本的蛋白浓度为100微克/100微升
• 如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度
• 蛋白酶活性单位浓度定义：在37℃下，pH 7.5的情况下，每单位酶在单位时间内（每分钟）产生0.01吸光值的升高变化
• 本公司提供系列细菌生理生化检测试剂产品

质量标准

• 本产品经鉴定性能稳定
• 本产品经鉴定检测敏感