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细菌脂肪酶(LIPASE)活性比色法定量检测试剂盒
点击次数:941 更新时间:2017-01-18

细菌脂肪酶(LIPASE)活性比色法定量检测试剂

产品说明书

 

主要用途

 

细菌脂肪酶(LIPASE)活性比色法定量检测试剂是一种旨在通过底物三丁酸二巯基丙醇受到脂肪酶水解,释放出巯基基团,使用Ellman试剂,产生黄色5-巯基-2-硝基苯甲酸产物吸光峰值的变化,即采用比色法来测定样品中酶活性的而经典的技术方法。该技术由大师级科学家精心改良、成功实验证明的。其适用于各种细菌细胞裂解液样品脂肪酶的总活性检测。产品严格无菌,即到即用,操作简捷,性能稳定。

 

技术背景

 

脂肪酶(lipase;EC3.1.1.3)是可溶性酶蛋白分子,催化不溶性脂质分子的酯键(ester bond)的水解。许多细菌产生细胞外酶(exoenzyme),称为水解酶(hydrolase),在水分子的参与下,催化底物的水解,成为细菌生理特征之一。其中脂肪酶(Lipase),裂解脂肪分子,例如甘油三酯(triglyceride;TAG)、脂肪、油等,产生1个分子甘油(glycerol)和3个分子脂肪酸分子(fatty acid),由此用于合成细菌脂质和其它细胞成分,以及氧化产生能量。食品工业中,常用于食品发酵(rancidity),例如人造奶油(margarine)等。甚至用于厨房清洁剂和替代能源的生物催化作用。同时据此用以识别革蓝氏阴性细菌,例如枯草芽孢杆菌(Bac. Subtilis)等。细菌脂肪酶在水分子的参与下,催化三丁酸二巯基丙醇(dimercaptopropanol tributyrate;DMPTB或BALB)的水解,产生二巯基丙醇(dimercaptopropanol;DMP),并释放出巯基基团(-SH),与Ellman试剂5,5-二硫基-双(2-硝基苯甲酸)[5,5’-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid);DTNB]反应后,产生黄色的5-巯基-2-硝基苯甲酸(5-thio-2-nitrobenzoic acid;TNB),通过其吸收峰值的变化(412nm波长),来定量分析脂肪酶的活性。脂肪酶反应系统为:

 

产品内容

 

裂解液(Reagent A)

毫升

活性液(Reagent B)

微升

缓冲液(Reagent C)

毫升

反应液(Reagent D)

毫升

底色液(Reagent E)

微升

补充液(Reagent F)

微升

说明书

1份

 

保存方式

 

保存 活性液(Reagent B)、 反应液(Reagent D)和 底色液(Reagent E)在-20℃冰箱里,其余的保存在4℃冰箱里; 底色液(Reagent E)避免光照,有效保证6月

 

用户自备

 

1.5毫升离心管:用于样品操作的容器

微型台式离心机:用于样品制备

恒温水槽:用于孵育反应

比色皿或酶标板:用于反应和比色的容器

分光光度仪或酶标仪:用于比色分析

 

实验步骤

 

一、 样品准备

 

1. 准备好xx微升待测细菌(OD600=0.4 至0.8,即1 至2 X 107细胞/毫升)

2. 转移到到 1.5 毫升离心管

3. 放进 4℃微型台式离心机离心5 分钟,速度为1000g(或3500RPM,例如EPPENDORF 5415)

4. 小心抽去上清液

5. 加入 xx 微升  裂解液(Reagent A),充分混匀

6. 加入 xx 微升  活性液(Reagent B)

7. 强力涡旋震荡 15 秒

8. 置于冰槽里 15 分钟

9. 放进 4℃微型台式离心机离心15 分钟,速度为16000g(或13000RPM,例如eppendorf 5415)

10.小心移取xx 微升上清液到新的预冷的1.5 毫升离心管

11.移取xx 微升进行蛋白定量检测

12.即刻放进-70℃保存或置于冰槽里继续后续操作

 

二、 测定准备

 

1. 准备好待测样品(例如细菌裂解萃取液等),置于冰槽里

2. 设定好分光光度仪(温度为 37℃):波长412nm,间隔10 分钟,读数4 次(共30 分钟),并置零

 

三、背景对照测定

 

1. 移取 xx 微升  缓冲液(Reagent C)到新的比色皿

2. 加入 xx 微升待测样品(100 微克细菌细胞裂解萃取液蛋白)(注意:样品须清澈)

3. 上下倾倒数次,混匀

4. 在 37℃温度下孵育2 分钟

5. (选择步骤)放进分光光度仪,置零

6. (选择步骤)取出比色皿

7. 加入 xx 微升  底色液(Reagent E)

8. 上下倾倒数次,混匀(限定在 3 秒之内)

9. 即刻放进分光光度仪检测,此为背景空对照(30 分钟读数-0 分钟读数)

 

四、 样品测定

 

1. 移取 xx 微升  缓冲液(Reagent C)到新的比色皿

2. 加入 xx 微升  反应液(Reagent D)

3. 加入xx微升待测样品(100微克细菌裂解液蛋白)(注意:样品须清澈)

4. 上下倾倒数次,混匀

5. 在37℃温度下孵育2分钟

6. (选择步骤)放进分光光度仪,置零

7. (选择步骤)取出比色皿

8. 加入xx微升 底色液(Reagent E)

9. 上下倾倒数次,混匀(限定在3秒之内)

10.即刻放进分光光度仪检测,此为样品读数(30分钟读数-0分钟读数)

11.(选择步骤)重复实验步骤1至8,测读新的样品

 

五、计算样品活性

 

单位=微摩尔DMPTB/分钟

 

六、酶标板测定

 

1. 在96孔酶标板上做好相应标记:背景对照和样品

2. 分别移取xx微升 缓冲液(Reagent C)到所有孔中

3. 加入xx微升 反应液(Reagent D)到样品孔里

4. 加入xx微升 阴性液(Reagent F)到背景对照孔里

5. 分别加入xx微升待测样品(20微克细菌裂解液蛋白)到所有孔里(注意:样品须清澈,且pH为7.2)

6. 轻轻摇动96孔酶标板

7. 在37℃温度下孵育2分钟

8. 分别加入xx微升 底色液(Reagent E)到所有孔里

9. 轻轻摇动酶标板

10.即刻放进酶标仪检测,包括(0分钟初始读数和30分钟读数)

11.活性计算

单位=微摩尔DMPTB/分钟

 

注意事项

 

1. 本产品为40次(酶标板,包括20次样品和20次背景对照)和10次(比色皿,包括5次样品和5次背景对照)操作

2. 操作时,须戴手套

3. 每次样品测定,需要背景测定一次

4. 样品须澄清,至关重要

5. 样品中避免含有TWEEN20、NP40、巯基乙醇、DTT等,否则干扰检测

6. 孵育反应完成后即刻进行比色测定

7. 比色测定后,比色皿须清洗*

8. 建议待测样本的蛋白浓度为100微克/50微升

9. 如果待测样品浓度过高或过低,可以调整样品浓度

10.酶活性单位浓度定义:在37℃下,pH 7.5的情况下,每单位酶在单位时间内(每分钟)水解1微摩尔三丁酸二巯基丙醇

11.本公司提供系列细菌生理生化检测试剂产品

 

质量标准

 

1. 本产品经鉴定性能稳定

2. 本产品经鉴定检测敏感

 

 

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