组织硫代巴比妥酸反应物（TBARS）比色法定量检测试剂盒 产品说明书（中文版） 主要用途 组织硫代巴比妥酸反应物（TBARS）比色法定量检测试剂是一种旨在通过TBARS（硫代巴比妥酸反应物）技术，检测与之反应的丙二醛，其产物丙二醛双硫代巴比妥酸加合物，在分光光度仪下，检测其吸光峰值的变化，即采用比色法测定组织样品中硫代巴比妥酸反应物含量的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种动物组织（人体、动物、昆虫等）中硫代巴比妥酸反应物的含量检测。广泛用于组织氧化应急研究，特别是脂质过氧化的分析。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，重复性好。 技术背景 脂质过氧化反应（lipid peroxidation；LPO）是动物和植物细胞损伤的一种机制，也是评价细胞和组织氧化应急的标志。含有两个或以上双键（double bond）的多聚不饱和脂肪酸（Polyunsaturated Fatty Acid）对自由基以及其它活性氧化族高度敏感，导致产生脂质过氧自由基LOO＋（lipid peroxyl radical），使脂类氧化（lipid oxidation）。脂质过氧化自由基LOO＋同时通过攻击分子内双键，经环化、裂解形成环状内过氧化物（cyclic endoperoxide），例如丙二醛（malondialdehyde；MDA）和4-羟基壬烯酸（4-hydroxynonenal；HNE）等氢过氧化物（hydroperoxide）和醛（aldehyde），为自然产生的脂质过氧化产物，属于硫代巴比妥酸反应物（TBARS）混合物。硫代巴比妥酸反应物含量增加，表明氧化应急增强。作为脂质过氧化性低分子量终端产物之一的丙二醛，广泛用于脂质过氧化反应的指标，即硫代巴比妥酸反应物（thiobarbituric acid reactive substance；TBARS）表述为丙二醛等类物（MDA equivalentlent），以评价脂质氧化或氧化应急程度。在丁羟甲苯（Butylated Hydroxytoluene；BHT）和EDTA的参与帮助减少干扰性脂类氧化的情况下，丙二醛与硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid；TBA）进行反应，产生丙二醛双硫代巴比妥酸加合物（MDA-TBA2），通过分光光度仪（532nm波长）来定量分析硫代巴比妥酸反应物的含量，其反应方式为： 产品内容 缓冲液（Reagent A） | 毫升 | 裂解液（Reagent B） | 毫升 | 抗干扰液（Reagent C） | 微升 | 萃取液（Reagent D） | 毫升 | 反应液（Reagent E） | 管 | 补充液（Reagent F） | 毫升 | 稀释液（Reagent G） | 毫升 | 产品说明书 | 1份 |
保存方式 保存在4℃冰箱里，抗干扰液（Reagent C）和反应液（Reagent E）避免光照，并密封；萃取液（Reagent D）具有腐蚀性，注意操作安全；有效保证6月 用户自备 15毫升锥形离心管：用于制备样品的容器 1.5毫升离心管：用于制备样品和样品反应的容器 超声仪：用于裂解组织的仪器 （微型）台式离心机：用于样品收集、澄清 恒温水槽：用于反应孵育 酶标板：用于比色的容器 酶标仪：用于样品比色分析 实验步骤 实验开始前，将试剂盒中的反应液（Reagent E） 置入冰槽里。移取xx微升稀释液（Reagent G）到 反应液（Reagent E）管里，涡旋混匀，标记为反应工作液（10次操作量）。同时设定好酶标仪（温度为25℃）：波长532nm。然后进行下列操作。 一、样品准备 - 手术取出动物组织，并秤重以确定组织重量
- （选择步骤）放进预冷的50毫升锥形离心管（500毫克组织）
- （选择步骤）加入xx毫升缓冲液（Reagent A）
- （选择步骤）小心抽去缓冲液（Reagent A）
- 移入到一个液氮冻存管
- 即刻放进液氮罐过夜
- 次日从液氮罐里取出，即刻（zui快速度）用研磨棒碾碎组织成粉末状（注意：切莫使组织冻融）
- 放进一个15毫升锥形离心管
- 加入置于冰槽里的xx微升裂解液（Reagent B）
- 强力涡旋震荡5秒，充分混匀
- 在冰槽里，置于200瓦超声仪下，功率50％，猝击5秒
- 转移到预冷的1.5毫升离心管
- 强力涡旋震荡15秒
- 放进4℃微型台式离心机离心10分钟，速度为3000g（或6000RPM，例如eppendorf 5415）
- 小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管
- （选择步骤）移取10微升进行蛋白定量测定，并调整蛋白浓度为20至50毫克/毫升
- 即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作
二、比色测定 - 准备10个1.5毫升离心管，并做好相应标记：背景对照和样品
- 分别移取xx微升缓冲液（Reagent A）
- 分别加入xx微升抗干扰液（Reagent C）
- 分别加入xx微升补充液（Reagent F）或待测样品（注意：总量为1至2毫克总蛋白）
- 用枪头混匀
- 分别加入xx微升萃取液（Reagent D）
- 用枪头混匀
- 分别加入xx微升反应工作液
- 盖上盖子，上下倾倒数次，混匀
- 放进60℃恒温水槽，孵育60分钟
- 放进冰槽里冷却2分钟
- 放进4℃微型台式离心机离心5分钟，速度为10000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
- 分别移取250微升上清液到96孔酶标板的相应孔里（注意：上清须澄清）
- 放进酶标仪检测
- 样品实际读数：（样品读数－背景对照读数）
三、计算样品总浓度 注意事项 - 本产品为20次操作
- 操作时，须戴手套
- 用户可以采用组织匀浆（30秒）处理代替超声处理
- 萃取液（Reagent D）具有腐蚀性，注意操作安全
- 反应液（Reagent E）为固体，避免在室温下放置；配制后，有效期1周
- 抗干扰液（Reagent C）和反应液（Reagent E）避免光照，并密封
- 本产品检测敏感度可达0.05微摩尔丙二醛等类物
- 50微摩尔的过氧化氢和0.25摩尔蔗糖会干扰检测（使丙二醛减少13％）
- 如果样品含有过高的蛋白成分，建议进行样品去蛋白处理
- 可以使用煮沸10分钟替代60℃孵育反应 60分钟
- 如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度
- 正常样品的硫代巴比妥酸反应物浓度相当低，约在皮摩尔水平，即10至100皮摩尔/毫克蛋白
- 本公司提供系列丙二醛检测试剂产品
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