植物染色质免疫沉淀分析(CHIP)试剂盒 产品说明书 主要用途 植物染色质免疫沉淀分析(CHIP)试剂是一种旨在通过甲醛交联、物理或化学处理细胞核以及染色质,从而运用特异抗体结合免疫沉淀,然后萃取DNA,扩增分析,来确定结合蛋白的目标DNA序列的而经典的技术方法。该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的。其适用于DNA复制、重组、修复、转录、病毒组装中的DNA和蛋白质(包括转录因子、聚合酶、组蛋白等)的相互作用的研究。广泛应用于定性检测各种植物组织(花瓣、叶片、种子等)DNA蛋白结合序列和定量检测序列特异性DNA结合蛋白(例如转录因子)及其突变形成等。产品即到即用,性能稳定,操作便捷,反应敏感,结合显著,重复性好。 技术背景 DNA和蛋白质的相互作用是调控细胞反应过程的要素之一。染色质免疫沉淀分析方法(chromatin immunoprecipitation;CHIP)是研究活体内(in vivo)DNA和蛋白质的相互作用的zui有力的工具:用于分析染色质结构动力学、转录因子调节、以及表观遗传学变异等。CHIP技术通过三大步骤实现:*,甲醛固定后染色质分离和断片;第二,运用特异蛋白之抗体,免疫共沉淀结合蛋白(包括转录因子、聚合酶、组蛋白等)的染色质片断;第三,分析目标DNA和蛋白的修饰。其中转录因子作为调节蛋白,通过结合核DNA,以达到控制基因表达。 产品内容 清理液(Reagent A) | 毫升 | 固着液(Reagent B) | 毫升 | 终止液(Reagent C) | 毫升 | 裂解液A(Reagent D) | 毫升 | 裂解液B(Reagent E) | 毫升 | 裂解液C(Reagent F) | 毫升 | 核溶液(Reagent G) | 毫升 | 稀释液(Reagent H) | 毫升 | 结合液(Reagent I) | 毫升 | 低盐液(Reagent J) | 毫升 | 高盐液(Reagent K) | 毫升 | 平衡液(Reagent L) | 毫升 | 缓冲液(Reagent M) | 毫升 | 洗脱液(Reagent N) | 毫升 | 解联液(Reagent O) | 毫升 | 酶解液(Reagent P) | 微升 | 萃取液(Reagent Q) | 毫升 | 浓缩液(Reagent R) | 毫升 | 沉淀液(Reagent S) | 毫升 | 净化液(Reagent T) | 毫升 | 扩增液(Reagent U) | 微升 | 补充液(Reagent V) | 毫升 | 说明书 | 1份 |
保存方式 保存裂解液A(Reagent D)、裂解液B(Reagent E)、裂解液C(Reagent F)、核溶液(Reagent G)、稀释液(Reagent H)、结合液(Reagent I)、解联液(Reagent O)、酶解液(Reagent P)、萃取液(Reagent Q)、浓缩液(Reagent R)和扩增液(Reagent U)在-20℃冰箱里,其余的保存在4℃冰箱里; 有效保证6月 用户自备 特异抗体:用于目标蛋白的结合 特异引物:用于目标DNA的扩增或测序 1.5毫升离心管:用于样品反应操作和保存的容器 2毫升离心管:用于样品反应操作和保存的容器 15毫升锥形离心管:用于样品处理的容器 50毫升锥形离心管:用于植物组织处理的容器 恒温水槽:用于孵育反应物 震荡器:用于混匀反应物 4℃微型台式离心机:用于沉淀样品 4℃台式离心机:用于沉淀样品 平式摇荡仪或摇床:用于孵育和混匀反应 DOUNCE匀浆器:用于裂解植物组织细胞 超声仪:用于裂解植物组织细胞核 PCR仪:用于扩增反应 电泳仪:用于检测扩增产物 实验步骤 实验开始前,准备好待测植物的预处理:药物处理等。同时将-20℃保存的试剂置于冰槽里融化。然后进行下列操作。 一、 植物组织细胞核分离 1. 准备好新鲜处理的植物组织(花瓣、叶片、种子等),并秤重1克组织重量 2. (选择步骤)放进预冷的50毫升锥形离心管 3. (选择步骤)加入 毫升清理液(Reagent A)清洗1次 4. 即刻用刀片切碎组织 5. 或置于液氮管过夜,次日取出后,即刻(zui快速度)碾碎组织成粉末(注意:切莫使组织冻融) 6. 放进15毫升锥形离心管 7. 加入 毫升室温预热的固着液(Reagent B) 8. 平放置于摇床,室温下(25℃)孵育15分钟,速度为100RPM 9. 加入 微升室温预热的终止液(Reagent C) 10.继续平放置于摇床,室温下(25℃)孵育5分钟,速度为100RPM 11.放进台式离心机离心5分钟,速度为1000g 12.小心抽去上清液 13.加入 毫升预冷的清理液(Reagent A),混匀 14.放进4℃台式离心机离心5分钟,速度为1000g 15.小心抽去上清液 16.重复实验步骤13至15二次 17.加入 毫升预冷的裂解液A(Reagent D),混匀 18.涡旋震荡5秒,充分混匀 19.置于冰槽里孵育10分钟 20.即刻放入预冷的DOUNCE匀浆器 21.在冰槽里用研磨棒匀化组织(约80下)(注意:参见注意事项6) 22.(选择步骤)准备1个小型漏斗,内衬尼龙丝,置于15毫升锥形离心管上 23.(选择步骤)将所有组织匀浆物移入到小型漏斗里过滤 24.将所有组织匀浆物移入15毫升锥形离心管 25.放进4℃台式离心机离心20分钟,速度为2000g 26.小心抽去上清液 27.加入 毫升裂解液B(Reagent E),混匀颗粒群 28.转移到1.5毫升离心管 29.放进4℃微型台式离心机离心10分钟,速度为16000g(或13000RPM,例如EPPENDORF 5415) 30.小心抽去上清液 31.加入 微升裂解液C(Reagent F),混匀颗粒群 32.准备1个新的1.5毫升离心管 33.加入 微升裂解液C(Reagent F) 34.小心加入 微升上述样品悬液在裂解液C(Reagent F)的上面 35.放进4℃微型台式离心机离心60分钟,速度为16000g(或13000RPM,例如EPPENDORF 5415) 36.小心抽去上清液 37.加入 毫升核溶液(Reagent G),混匀颗粒群 38.置于冰槽里孵育10分钟 39.置于200瓦超声仪下,功率50%,猝击20秒,间隙10秒冷却,重复3次(注意:根据DNA的片段大小,增加超声次数) 40.放进4℃微型台式离心机离心10分钟,速度为16000g(或13000RPM,例如EPPENDORF 5415) 41.小心移取上清液分装到10个2毫升离心管(100微升/管) 42.其中: 1)选择1管进行1:50稀释后,测定OD260,确定DNA含量,使所有样品的检测浓度调整一致(注意:建议OD260=0.1为佳) 2)或选择1管进行蛋白浓度检测,使所有样品的检测浓度调整一致(注意:蛋白总量1至5毫克为佳; 3)或选择1管进行去交联以及电泳鉴定超声处理的DNA片段(0.3至1.5kb)(注意:参见注意事项7) 43.选择1管继续后续操作,其余的保存在-70℃冰箱里 44.加入 微升稀释液(Reagent H) 二、 结合反应 1. 加入 微升结合液(Reagent I) 2. 平放置于4℃摇床孵育1小时,速度为100RPM 3. 放进4℃微型台式离心机离心1分钟,速度为400g(或2000RPM,例如eppendorf 5415) 4. 小心移取上清液到2个新的2毫升离心管(每管500微升:1管为无抗体对照;1管为抗体处理管) 5. 加入50微升用户自备的特异抗体(总量为5微克)到抗体处理管 6. 将对照和抗体管平放置于4℃摇床孵育16小时,速度为100RPM 7. 加入 微升结合液(Reagent I)到抗体处理管 8. 将对照和抗体管平放置于4℃摇床孵育2小时,速度为100RPM 9. 将抗体管放进4℃微型台式离心机离心1分钟,速度为400g(或2000RPM,例如eppendorf 5415) 10.小心抽去上清液 11.加入 毫升低盐液(Reagent J)到抗体管,混匀 12.平放置于4℃摇床孵育5分钟,速度为100RPM 13.放进4℃微型台式离心机离心1分钟,速度为400g(或2000RPM,例如eppendorf 5415) 14.小心抽去上清液 15.加入 毫升高盐液(Reagent K)到抗体管,混匀 16.平放置于4℃摇床孵育5分钟,速度为100RPM 17.放进4℃微型台式离心机离心1分钟,速度为400g(或2000RPM,例如eppendorf 5415) 18.小心抽去上清液 19.加入 毫升平衡液(Reagent L)到抗体管,混匀 20.平放置于4℃摇床孵育5分钟,速度为100RPM 21.放进4℃微型台式离心机离心1分钟,速度为400g(或2000RPM,例如eppendorf 5415) 22.小心抽去上清液 23.加入 毫升缓冲液(Reagent M)到抗体管,混匀 24.平放置于4℃摇床孵育5分钟,速度为100RPM 25.放进4℃微型台式离心机离心1分钟,速度为400g(或2000RPM,例如eppendorf 5415) 26.小心抽去上清液 27.重复实验步骤23至26一次 28.加入 微升洗脱液(Reagent N)到抗体管,混匀 29.平放置于摇床,室温下孵育15分钟,速度为100RPM 30.放进4℃微型台式离心机离心3分钟,速度为400g(或2000RPM,例如eppendorf 5415) 31.小心移取上清液到新的2毫升离心管 32.重复实验步骤28至31一次 33.小心移取上清液合并到上述2毫升离心管(注意:可以暂时停止,存放在-20℃,次日继续) 三、 DNA萃取 1. 分别加入 微升解联液(Reagent O)到抗体处理管和无抗体对照管,混匀 2. 置于65℃恒温水槽孵育2小时 3. 分别加入 微升酶解液(Reagent P) 4. 置于55℃恒温水槽孵育2小时 5. 室温下静置15分钟 6. 分别加入 微升萃取液(Reagent Q)(注意:使用前摇匀) 7. 涡旋震荡15秒 8. 放进微型台式离心机离心5分钟,速度为16000g(或13000RPM,例如eppendorf 5415) 9. 分别移出450微升上层液相溶液到2个新的2毫升离心管(注意:切莫触碰液相交界面上的白色膜状物) 10.分别加入 微升浓缩液(Reagent R)到新的离心管 11.分别加入 毫升沉淀液(Reagent S) 12.涡旋震荡15秒 13.放进微型台式微型离心机离心15分钟,速度为16000g(或13000RPM,例如eppendorf 5415)(注意:离心前做好方位标记,以便离心后观察管底沉淀颗粒) 14.小心抽掉上清液 15.分别加入 毫升净化液(Reagent T) 16.放进微型台式离心机离心5分钟,速度为16000g(或13000RPM,例如eppendorf 5415) 17.小心抽掉上清液 18.空气中晾干沉淀颗粒群 19.分别加入 微升缓冲液(Reagent M) 20.溶解后放进-20℃冰箱保存 四、 PCR扩增 1. 将扩增液(Reagent U)和补充液(Reagent V)从-20℃冰箱里取出 2. 置入冰槽里直至融化 3. 针对一个样本,每次移出 微升扩增液(Reagent U)到PCR管 4. 加入2微升上述结合实验中获得的DNA样品(总量100纳克) 5. 分别加入1微升用户自备的特异性的引物F和引物R(各350纳克或25微摩尔) 6. 再加入 微升补充液(Reagent V)(反应总量为25微升) 7. 即刻放进微型台式离心机瞬时离心5秒,速度为500g(或2000RPM;例如eppendorf 5415) 8. 加入50微升PCR级矿物油(注意:参见注意事项9) 9. 即刻进行热启动PCR反应: 温度(℃) | 时间 | 循环 | 95 | 2分钟 | 1 | 95 Tm 72 | 30秒 1分钟 30秒 | 35 | 72 | 5分钟 | 1 |
10.反应完毕后,移取5微升进行1.5%琼脂糖凝胶电泳 11.如果进行测序鉴定,胶回收PCR产物(建议使用高质纯化一步法胶回收试剂盒; 12.分别移出2微升反应液到2个不同的新的1.5毫升离心管(每微升100纳克) 13.加入1微升用户自备的特异性巢式引物F(每微升350纳克)到其中一个1.5毫升离心管,作好标记 14.加入1微升用户自备的特异性巢式引物R(每微升350纳克)到另一个1.5毫升离心管,作好标记 15.进行后续的直接测序反应 注意事项 1. 本产品为10次(1克植物组织样本)操作 2. 操作时,须戴手套 3. 固着处理必须在室温下进行,其余的操作均须在4℃状态进行 4. 严格按照操作规程进行 5. 建议使用无抗体对照 6. 通常匀化次数为80下达到80%的组织细胞裂解为理想状态,但不同的组织类型会存在差异。用户可以通过显微镜观察3微升匀浆物的组织细胞裂解程度:完整细胞呈现发亮的圆环。低于50%可以增加匀化次数 7. 通常超声处理后的DNA片段大小为0.3至1.5kb;如果使片段小于1.0kb,增加超声次数或功率即可。电泳鉴定前,加入10微升解联液(Reagent O)到1管100微升超声处理后样品,65℃孵育4小时,移取20微升进行1.0%琼脂糖凝胶电泳。其标准片段电泳图象如下:泳道1为DNA标准样;泳道2为未经超声处理样品;泳道3为超声处理后样品;泳道4为强化超声处理后样品
8. 根据用户PCR仪的性能,决定是否加入矿物油(Mineral Oil) 9. 建议使用软件测算Tm温度;参考公式为Tm=4(G+C)+2(A+T) 10.在-20℃冰箱里储存的产品避免反复冻融 11.本公司提供系列CHIP分析试剂产品 质量标准 1. 本产品经鉴定性能稳定 2. 本产品经鉴定不含污染性蛋白酶和核酶 |