细胞/组织高尔基体粗提分离试剂盒

产品说明书
主要用途
细胞/组织高尔基体粗提分离试剂是一种旨在通过机械或化学处理，差速以及等密度离心方法，从动物细胞
或软组织中分离出完整的高尔基体细胞器组分的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验
证明的。适合于各种动物细胞或组织（人体、老鼠、兔子等）样品中高尔基体的制备。可以被用于受体循
环、糖蛋白和脂蛋白合成，以及抗体释放机制等研究。产品不含污染性蛋白酶和核酶，即到即用，性能稳
定，分离产量高。
技术背景
高尔基体（Golgi apparatus或Golgi body），又称为高尔基复合体（Golgi complex），是大多数真核细胞的细
胞器组分，由40至100扁平片层或称为小池（cisternae）堆叠成内膜系统（endomembrane system），分成正
侧或内侧网络（cis-Golgi network）、近内中间网络（medial-Golgi）、内腔网络（endo-Golgi）、外侧或反侧网
络等（trans-Golgi）细胞内小管（tubules）、囊泡（vesicles）和小池（cisternae/sac）相互连接的网络结构，
其主要功能在于由内侧网络接受内质网囊泡中的蛋白质和脂类等生物大分子，处理（修饰、分类）和组装
后，由外侧网络转运分泌到目标位置。同时也是合成蛋白聚糖（proteoglycan）和碳水化合物的重要场所。
高尔基体的分离是现代细胞生物学研究的常用手段之一：*，通过机械或化学方法破裂组织细胞；第二，
通过低速差速离心去除残渣碎屑和巨大细胞器；第三，可以通过等密度离心获得高尔基体。
产品内容
清理液（Reagent A） 毫升
裂解液（Reagent B） 毫升
分离液A（Reagent C） 毫升
分离液B（Reagent D） 毫升
保存液（Reagent E） 毫升
产品说明书1 份
保存方式
保存在4℃冰箱里，有效保证6 月
用户自备
HANK 平衡盐缓冲溶液或PBS 缓冲溶液：用于清理细胞
胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液：用于细胞脱离
*细胞培养液：用于中和胰蛋白酶的细胞培养基
15 毫升锥形离心管：用于样品制备的容器
1.5 毫升离心管：用于样品保存的容器
8 毫升超速离心管：用于超高速离心的容器
2
4℃（微型）台式离心机：用于样品制备
4℃超速离心机：用于样品制备
DOUNCE 匀浆器：用于裂解组织
平式摇荡仪：用于混匀
3 号针筒和18 号针头：用于收集样品
实验步骤
一、细胞样品
1． 准备5 至10 瓶75cm2 细胞培养瓶的细胞（5 X 107），直至细胞生长铺满整个培养表面
2． 分别加入10 毫升用户自备的HANK 平衡盐缓冲溶液或PBS 缓冲溶液到每个细胞培养瓶，覆盖培养瓶
表面，然后抽去
3． 重复实验步骤2 一次
4． 加入3 毫升用户自备的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，铺满整个细胞生长表面
5． 置入37℃培养箱3 分种
6． 轻轻手击震动培养瓶，使细胞脱落
7． 分别加入10 毫升用户自备的*细胞培养液
8． 移入一个50 毫升锥形离心管
9． 放进台式离心机离心10 分钟，速度为200g
10．小心抽去上清液
11．加入xx 毫升预冷的清理液（Reagent A），混匀细胞
12．放进台式离心机离心10 分钟，速度为300g
13．小心抽去上清液
14．加入预冷的xx 毫升裂解液（Reagent B）
15．涡旋震荡5 秒，充分混匀
16．即刻放入预冷的DOUNCE 匀浆器
17．在冰槽里用匀浆棒匀化组织（约20 至40 下）（注意：参见注意事项7）
18．将所有组织匀浆物移入15 毫升锥形离心管
19．放进4℃台式离心机离心15 分钟，速度为3000g
20．小心移出上清液到另一个新的预冷的15 毫升锥形离心管——
21．放进－70℃冰箱里备用或放进冰槽里继续后续操作
22．移取xx 毫升的分离液A（Reagent C）到8 毫升超速离心管
23．小心加入xx 毫升的分离液B（Reagent D）在分离液A（Reagent C）的上面，避免震动
24．轻轻加入xx 毫升上述高尔基体混匀液在分离液B（Reagent D）的上面，避免震动
25．放进4℃超速离心机离心4 小时，速度为100000g
26．小心取出超速离心管：可见样品和分离液B（Reagent D）交界处棕色或乳黄色样品带
27．小心收集高尔基体样品带到8 毫升超速离心管（注意：用3 毫升针筒和18 号针头，置于样品带下缘小
心缓慢抽吸）
28．加入xx 毫升保存液（Reagent E）
29．放进4℃超速离心机离心30 分钟，速度为100000g
30．小心抽去上清液
31．加入xx 微升保存液（Reagent E），混匀
32．即刻移入到预冷的1.5 毫升离心管
3
33．放进－70℃冰箱里保存
二、组织样品
1． 手术取出动物组织，避免或去除脂肪组织，秤重以确定1 克组织重量（实验前使动物空腹12 至
24 小时）
2． （选择步骤）放进预冷的15 毫升锥形离心管
3． （选择步骤）加入xx 毫升清理液（Reagent A）清洗1 次
4． 即刻用刀片切碎组织
5． 放进一个预冷的15 毫升锥形离心管
6． 加入预冷的xx 毫升裂解液（Reagent B）
7． 涡旋震荡5 秒，充分混匀
8． 即刻放入预冷的DOUNCE 匀浆器
9． 在冰槽里用匀浆棒匀化组织（约20 至40 下）（注意：参见注意事项7）
10．将所有组织匀浆物移入15 毫升锥形离心管
11．放进4℃台式离心机离心15 分钟，速度为3000g
12．小心移出上清液到另一个新的预冷的15 毫升锥形离心管——
13．放进－70℃冰箱里备用或放进冰槽里继续后续操作
14．移取xx 毫升的分离液A（Reagent C）到8 毫升超速离心管
15．小心加入xx 毫升的分离液B（Reagent D）在分离液A（Reagent C）的上面，避免震动
16．轻轻加入xx 毫升上述高尔基体混匀液在分离液B（Reagent D）的上面，避免震动
17．放进4℃超速离心机离心4 小时，速度为100000g
18．小心取出超速离心管：可见样品和分离液B（Reagent D）交界处棕色或乳黄色样品带
19．小心收集高尔基体样品带到8 毫升超速离心管（注意：用3 毫升针筒和18 号针头，置于样品带下缘小
心缓慢抽吸）
20．加入xx 毫升保存液（Reagent E）
21．放进4℃超速离心机离心30 分钟，速度为100000g
22．小心抽去上清液
23．加入xx 微升保存液（Reagent E），混匀
24．即刻移入到预冷的1.5 毫升离心管
25．放进－70℃冰箱里保存
注意事项
1． 本产品为10 次（1 克动物组织或5 X 107 细胞）操作
2． 操作时，须戴手套
3． 操作时，避免污染母液，尤其是裂解液（Reagent B）、分离液A/B（Reagent C/D）和保存液（Reagent
E）
4． 所有操作均须在4℃或以下状态进行
5． 建议使用足够的样品量
6． 建议严格控制操作时间
7． 通常匀化次数为20 至40 下（或细胞颗粒群/组织块状消失为止）达到80％的细胞裂解为理想状态，但
不同的组织或细胞类型会存在差异。用户可以通过显微镜观察3 微升匀浆物的细胞裂解程度：完整细
胞呈现发亮的圆环。低于50％可以增加匀化次数
4
8． 根据超速离心管的大小调整分离液A/B（Reagent C/D）的使用量或在样品上面加上石蜡油填满
9． 通常1 克动物组织的高尔基体含量为15 微克蛋白
10．本产品所获得的高尔基体纯度和产量zui为理想
11．高尔基体的标志蛋白是UDP半乳糖转移酶（UDP-glactosyl transferase）；建议使用纯化高尔基体UDP半
乳糖转移酶（UDP-glactosyl transferase）活性比色法定量检测试剂盒
12．本公司提供系列亚细胞结构分析试剂产品
质量标准
1． 本产品经鉴定性能稳定
2． 本产品经鉴定分离的高尔基体维持正常活性
3． 本产品经鉴定不含污染性蛋白酶和核酶