细胞NADH心肌黄酶活性染色试剂盒

产品说明书
主要用途
细胞NADH心肌黄酶活性染色试剂是一种旨在使用人工电子受体染料二甲基噻唑二苯基四唑嗅蓝（MTT），受到NADH心肌黄酶催化还原，产生不溶性蓝黑色色素沉淀，来细胞中酶活性的而经典的技术方法。该技术由大师级科学家精心改良传统方法、成功实验证明的。主要适用于各种动物细胞的心肌黄酶活性定性检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，显色清晰。
技术背景
心肌黄酶（Diaphorase），又称为硫辛酰胺脱氢酶（lipoamide dehydrogenase），黄递酶，二氢硫辛酰胺脱氢酶（dihydrolipoamide dehydrogenase），二氢硫辛酸脱氢酶（dihydrolipoyl dehydrogenase）等。因早期从猪心肌中提取，产品又呈现荧光的黄绿色蛋白质，故被称为心肌黄酶。分子量102000至110000。NADH心肌黄酶直接和黄素蛋白（Flavoprotein）反应，释放出氢原子，将氧化型黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）还原为还原型黄素腺嘌呤二核苷酸（FADH2），传递氢原子给氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD），而形成还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH），作为电子供体，还原人工电子受体，例如染料四氮唑兰（tetrazolium）化合物，包括硝基蓝四氮唑（Nitro Blue Tetrazolium；NBT）和二甲基噻唑二苯基四唑嗅蓝（3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide；MTT），产生不溶性甲暨色素，由此用于鉴别内脏神经细胞等各种动物细胞。
产品内容
清理液（Reagent A） 毫升
固着液（Reagent B） 毫升
染色液（Reagent C） 毫升
反应液（Reagent D） 毫升
产品说明书 1份
保存方式
保存染色液（Reagent C）和反应液（Reagent D）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里，有效保证6月
用户自备
2毫升离心管：用于配制染色工作液
15毫升锥形离心管：用于配制染色工作液
培养箱：用于反应孵育
光学显微镜：用于切片染色后观察分析
1
实验步骤
操作一、25cm2细胞培养瓶染色
染色开始前，将－20℃冰箱里的试剂置于室温下融化；移取xx毫升染色液（Reagent C）到新的2毫升离心管，加入2xx微升 反应液（Reagent D），混匀后，标记为染色工作液，置于冰槽里，避免光照。然后进行下列操作。
1． 小心抽去25cm2细胞培养瓶里的培养液
2． 小心加入xx毫升清理液（Reagent A），清洗生长中的细胞表面
3． 小心抽去清理液
4． 小心加入xx毫升固定液（Reagent B），覆盖整个生长表面
5． 在室温下孵育5分钟
6． 小心抽去固定液
7． 小心加入xx毫升清理液（Reagent A），清洗细胞表面
8． 小心抽去清理液
9． 重复实验步骤7和8二次
10．小心加入xx毫升染色工作液，覆盖整个细胞表面
11．放进37℃培养箱，孵育5分钟至60分钟，或细胞呈现蓝黑色
12．小心抽去染色工作液
13．每孔加入xx毫升清理液（Reagent A），清洗细胞表面
14．小心抽去清理液
15．重复实验步骤13和14二次
16．即刻在光学显微镜下观察和计数：表达NADH心肌黄酶的组织细胞为阳性组织细胞，呈现蓝黑色。
操作二、24孔细胞培养板染色
染色开始前，将－20℃冰箱里的试剂置于室温下融化；移取xx毫升染色液（Reagent C）到新的15毫升锥形离心管，加入xx毫升反应液（Reagent D），混匀后，标记为染色工作液，置于冰槽里，避免光照。然后进行下列操作。
1. 小心抽去24孔细胞培养板里的培养液
2. 每孔加入xx微升清理液（Reagent A），清洗生长中的细胞表面
3. 小心抽去每孔里的清理液
4. 每孔加入xx微升固定液（Reagent B），覆盖整个生长表面
5. 在室温下孵育5分钟
6. 小心抽去固定液
7. 每孔加入xx微升清理液（Reagent A），清洗细胞表面
8. 小心抽去清理液
9. 重复实验步骤7和8二次
10. 每孔加入xx微升染色工作液，覆盖整个细胞表面
11. 放进37℃培养箱，孵育5分钟至60分钟，或细胞呈现蓝黑色
12. 小心抽去染色工作液
13. 每孔加入xx微升清理液（Reagent A），清洗细胞表面 2
14. 小心抽去清理液
15. 重复实验步骤13和14二次
16. 即刻在光学显微镜下观察和计数：表达NADH心肌黄酶的组织细胞为阳性组织细胞，呈现蓝黑色
注意事项
1． 本产品为50次（2个24孔板）或10次（10个25cm2细胞培养瓶）操作
2． 操作时，须戴手套
3． 反应液（Reagent D）避免反复冻融
4． 阴性对照时，染色工作液不含有反应液（Reagent D）
5． 每次更换试剂溶液时，保持切片面基本晾干
6． 试剂溶液在切片表面时，避免有气泡存在，同时确保铺满切片表面
7． 整个操作，在避光状态下进行
8． 染色孵育时间，根据样品和酶活性强弱调整，通常为5至60分钟
9． 染色完成后，即刻进行光学显微镜观察
10．样品染色后保存，避免光照
11． 本产品适合各种规格的培养细胞：载玻片，载玻片培养皿，35mm培养皿，和各种培养孔板，须相应调整处理液：
操作容器
建议处理液规格
载玻片
100微升
载玻片培养皿
1毫升
35mm培养皿
1毫升
96孔培养板
100微升
48孔培养板
200微升
24孔培养板
500微升
12孔培养板
1毫升
6孔培养板
2毫升
25cm2细胞培养瓶
3毫升
12．本公司提供NADH心肌黄酶活性NBT染色试剂产品
13．本公司提供系列组织细胞酶活性染色试剂产品
质量标准
1． 本产品经鉴定性能稳定
2． 本产品经鉴定显色清晰