组织葡萄糖-6-磷酸脱氢酶酶动力比色法定量检测试剂盒

产品说明书

主要用途
组织葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）活性酶动力比色法定量检测试剂是一种旨在通过特异反应系统中氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）还原后峰值的增高，即采用比色法来测定组织裂解样品中酶活性的而经典的技术方法。该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的。其适用于各种组织裂解悬液样品（动物、人体、植物、昆虫、细菌等）葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的总活性检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。
技术背景
葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（Glucose-6-phosphate dehydrogenase；G6PD）是一种细胞浆中的酶，参与磷酸戊糖代谢通路，通过维持还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）水平，提供细胞还原性能量，进而保持谷胱甘肽水平，帮助细胞，例如红细胞，防止氧化损伤。同时NADPH的产生，促进组织细胞（例如肝脏、脂肪组织、肾上腺等）生物合成脂肪酸、类异戊二烯等。在植物中，存在葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的多种异构体，位于细胞浆、质体基质（plastidic stroma）、和过氧化体。葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺陷将导致急性溶血性贫血，即蚕豆病。基于葡萄糖-6-磷酸（D-glucose-6-phosphate）在葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的作用下，转化为6-磷酸葡萄糖酸内脂（6-phosphoglucono-δ-lactone） 产物后，同时其辅酶因子氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（xoidized nicotinamide adenine dinucleotide phosphate；β-NADP）转化为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate；β-NADPH），通过测定吸光值的变化（340nm 波长），来定量分析葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的总活性。葡萄糖-6-磷酸脱氢酶反应系统为：
产品内容
清理液（Reagent A） 毫升
裂解液（Reagent B） 毫升
缓冲液（Reagent C） 毫升
反应液（Reagent D） 毫升
底色液（Reagent E） 毫升
阴性液（Reagent F） 毫升
产品说明书 1份
保存方式
保存裂解液（Reagent B）、缓冲液（Reagent C）、反应液（Reagent D）和底色液（Reagent E）在－20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里；反应液（Reagent D）和底色液（Reagent E）避免光照；有效保证6月
用户自备
1
1.5毫升离心管：用于样品制备和保存的容器
15毫升锥形离心管：用于样品制备的容器
（微型）台式离心机：用于样品操作
比色皿或酶标板：用于比色的容器
分光光度仪或酶标板：用于比色分析
实验步骤
实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的裂解液（Reagent B）置入冰槽里融化。然后进行下列操作。
一、 样品准备
1． 手术取出动物组织，并秤重500毫克组织重量
2． （选择步骤）放进预冷的50毫升锥形离心管
3． （选择步骤）加入xx毫升清理液（Reagent A）清洗
4． （选择步骤）抽去清理液
5． 移入到一个液氮冻存管
6． 即刻放进液氮罐过夜
7． 次日从液氮罐里取出，即刻（zui快速度）用研磨棒碾碎组织成粉末状（注意：切莫使组织冻融）
8． 放进一个15毫升锥形离心管
9． 加入置于冰槽里的xx微升裂解液（Reagent B）
10．强力涡旋震荡30秒，充分混匀
11．放进冰槽里孵育30分钟，期间每10分钟强力涡旋震荡30秒（注意：如需暂时停止，放进－70℃冰箱里储存备用）
12．即刻放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为10000g
13．小心移取上清液到新的无菌的1.5毫升离心管
14．移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－）
15．放进－70℃的冰箱里保存或置于冰槽里备用
二、 测定准备
1． 开启并设定好分光光度仪（温度为25℃）：波长340nm，间隔60秒，读数6次（共5分钟），并置零
2． 从－20℃冰箱里取出试剂，置于冰槽里融化；底色液（Reagent E）避免光照
三、 背景对照测定
1． 移取xx微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入xx微升反应液（Reagent D）
3． 加入xx微升阴性液（Reagent F）
4． 上下倾倒数次，混匀
5． 在25℃温度下孵育2分钟
6． （选择步骤）放进分光光度仪，置零 2
7． （选择步骤）取出比色皿
8． 加入xx微升底色液（Reagent E）
9． 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
10．即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照（5分钟读数－0分钟读数）
四、 样品测定
1． 移取xx微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入xx微升反应液（Reagent D）
3． 加入5微升待测样品（20微克蛋白）（注意：样品须清澈）
4． 上下倾倒数次，混匀
5． 在25℃温度下孵育2分钟
6． （选择步骤）放进分光光度仪，置零
7． （选择步骤）取出比色皿
8． 加入xx微升底色液（Reagent E）
9． 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
10．即刻放进分光光度仪检测，此为样品读数（5分钟读数－0分钟读数）
11．（选择步骤）重复实验步骤1至10，测读新的样品
五、计算样品活性
[（样品读数－背景读数）X （分钟）]＝单位/毫升÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝单位/毫克
单位＝微摩尔葡萄糖-6-磷酸/分钟
六、 酶标板测定
1． 在96孔酶标板上做好相应标记：背景对照和样品
2． 分别移取xx微升缓冲液（Reagent C）到96孔板中
3． 分别加入xx微升反应液（Reagent D）
4． 分别加入xx微升阴性液（Reagent F）或待测样品（20微克蛋白）到相应孔中（注意：样品须清澈）
5． 轻轻摇动96孔酶标板
6． 在25℃温度下孵育2分钟
7． 分别加入xx微升底色液（Reagent E）
8． 轻轻摇动酶标板
9． 即刻放进酶标仪检测：5分钟读数和0分钟读数
10．活性计算
[（样品读数－背景读数）X样品稀释倍数X （分钟）]＝单位/毫升÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝单位/毫克
单位＝微摩尔葡萄糖-6-磷酸/分钟
3
注意事项
1． 本产品为50次操作，包括背景对照
2． 操作时，须戴手套
3． 系统操作过程中，背景测定只需1次
4． 建议使用比色皿测定
5． 样品须澄清，至关重要
6． 加样后3秒内比色测定
7． 测定值由低到高变化；测定可持续5分钟
8． 比色测定后，比色皿须清洗*
9． 样本测定5分钟读数高于0分钟读数表明具有酶活性
10．建议待测样本蛋白浓度为20微克/5微升；如果样本酶活性过低或过高，则可以增加或降低样本量（本公司提供 Bradford）
11．如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度
12．葡萄糖-6-磷酸脱氢酶单位活性定义为：在25℃，pH 7.4条件下，每分钟内能够转化1微摩尔葡萄糖糖-6-磷酸至6-磷酸葡萄糖酸内脂所需的酶量作为一个活性单位
13．本公司提供系列医学生化经典分析试剂产品
质量标准
1． 本产品经鉴定性能稳定
2． 本产品经鉴定检测敏感
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蛋白质浓度定量试剂盒