细菌β-半乳糖苷酶活性比色法定量检测试剂盒产品说明书（中文版） 主要用途 细菌β-半乳糖苷酶活性比色法定量检测试剂是一种旨在使用化学方法，快速有效地裂解细菌细胞，通过高速离心，获得澄清细菌裂解悬液，在β-半乳糖苷酶反应体系里，以邻硝基苯基-β-D- 半乳糖苷为无色底物，水解所产生的亮黄色的邻硝基酚，即采用比色法定量测定细菌裂解悬液制备样品中的β-半乳糖苷酶活性的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。广泛应用于基因组学、蛋白质组学和其它分子生物学研究。其适用于活体细菌内源性或外源性β-半乳糖苷酶活性分析。产品即到即用，性能稳定，参数优化，操作简便、比色敏感，堪称上同类产品zui为上佳。 技术背景 大肠杆菌的标志基因Lac Z编码β-半乳糖苷酶（β-galactosidase ； β-gal），在其催化作用下，半乳糖可从乳糖的水解作用中得到。β-半乳糖苷酶非常稳定，对蛋白水解降解作用抗性强，且容易测试。因此β-半乳糖苷酶成为目前zui常用的报告基因，以评价载体转染的效果。邻硝基苯基-β-D-半乳糖苷（o-nitrophenyl-β-D-galactopyraniside；ONPG），是一种无色底物，以替代乳糖，在β-半乳糖苷酶的催化下，水解成无色的半乳糖和亮黄色的邻硝基酚（o-nitrophenol；ONP），通过420nm波长的吸光值分析，来测定β-半乳糖苷酶的活性单位。 产品内容 裂解液（Reagent A） | 毫升 | 活性液（Reagent B） | 毫升 | 稀释液（Reagent C） | 毫升 | 反应液（Reagent D） | 毫升 | 终止液（Reagent E） | 毫升 | 产品说明书 | 1份 |
保存方式 保存裂解液（Reagent A）、活性液（Reagent B）和反应液（Reagent D）在－20℃冰箱里，避免反复冻融；其余的保存在4℃冰箱里；反应液（Reagent D）避免光照；有效保证6月 用户自备 15毫升锥形离心管：用于样品操作的容器 1.5毫升离心管：用于样品操作的容器 （微型）台式离心机：用于样品操作 比色皿：用于比色分析的容器 恒温水槽或培养箱：用于反应物孵育 计时器：用于反应计时 分光光度仪：用于比色分析 实验步骤 实验开始前，开启分光光度仪预热，设置波长420nm；开启恒温水槽，设置温度为37℃。同时从－20℃冰箱里取出裂解液（Reagent A）、活性液（Reagent B）和反应液（Reagent D）置于冰槽里融化反应液（Reagent D）避免光照。然后进行下列操作： - 准备好10毫升待测的细菌放进37℃摇床孵育16小时，速度为220RPM
- 移取500微升过夜培养的细菌到15毫升锥形离心管
- 加入用户自备的10毫升新鲜培养液和诱导剂
- 放进37℃摇床孵育2小时，速度为220RPM（OD600＝0.4至0.8，即1至2 X 107细胞/毫升）
- 置于冰槽里5分钟
- 放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为1000g
- 小心抽去上清液
- 加入xx微升裂解液（Reagent A），充分混匀
- 转移到预冷的1.5毫升离心管
- 加入xx微升活性液（Reagent B）
- 强力涡旋震荡15秒
- 置于冰槽里15分钟
- 放进4℃微型台式离心机离心15分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
- 小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管
- 移取10微升进行蛋白定量检测
- 即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作
方法一：常规检测（比色皿） - 移取100微升上述制备的细菌细胞裂解悬液样品到新的比色皿
- 加入xx微升稀释液（Reagent C）
- 上下倾倒数次，混匀
- 放进37℃恒温水槽孵育5分钟
- 加入xx微升反应液（Reagent D）（注意：使用前，充分混匀反应液（Reagent D）中可能的沉淀）
- 上下倾倒数次，混匀，同时开启计时器进行计时
- 放进37℃恒温水槽孵育至少10分钟，或直至出现亮黄色（注意：参见注意事项14）
- 加入xx微升终止液（Reagent E），同时关闭计时器结束计时
- 记录反应所用的实际时间
10. 即刻放入分光光度仪检测，记录样品吸光读数 方法二：微量检测（酶标板） - 移取10微升上述制备的细菌细胞裂解悬液样品到酶标板中的1个孔里
- 加入xx微升稀释液（Reagent C）
- 轻轻摇动酶标板数次，混匀
- 放进37℃培养箱孵育5分钟
- 加入xx微升反应液（Reagent D）（注意：使用前，充分混匀反应液（Reagent D）中可能的沉淀）
- 轻轻摇动酶标板数次，混匀，同时开启计时器进行计时
- 放进37℃培养箱孵育至少10分钟，直至出现亮黄色（注意：参见注意事项14）
- 加入xx微升终止液（Reagent E），同时关闭计时器结束计时
- 记录反应所用的实际时间
- 即刻放入分光光度仪检测，记录样品吸光读数，
- 移取xx微升裂解液（Reagent A）到1.5毫升离心管
- 加入xx微升稀释液（Reagent C）
- 使用牙签、200微升枪头或接种环挑选1个完整菌落
- 涡旋震荡15秒，混匀
- 放进分光光度仪检测，波长为600nm，记录读数
- 放进37℃恒温水槽孵育5分钟
- 加入xx微升反应液（Reagent D）（注意：使用前，充分混匀反应液（Reagent D）中可能的沉淀）
- 上下倾倒数次，混匀，同时开启计时器进行计时
- 放进37℃恒温水槽孵育至少10分钟，直至出现亮黄色（注意：参见注意事项14）
- 加入xx微升终止液（Reagent E），同时关闭计时器结束计时
- 记录反应所用的实际时间
- 放进4℃台式离心机离心30秒，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
- 小心移取上清液到比色皿
- 即刻放入分光光度仪检测，记录样品吸光读数，
注意事项 - 本产品为20次（比色皿）操作
- 建议使用核内表达的载体代替胞内表达的载体转染或感染细胞或组织
- 本产品的各项参数达到*化
- 所有操作均须无菌状态下进行
- 操作时，须戴手套
- 反应液（Reagent D）避免光照和反复冻融
- 用户可以测定细胞裂解悬液的蛋白浓度，便于计算活性单位之需
- 如果用户需要测定背景空对照，可以*按照活性检测的操作步骤进行，*变化在于100微升样品改成100微升裂解液（Reagent A）替代
- 如果用户测得背景空对照，计算活性时，勿忘（样品吸光读数－背景空对照读数）
- 反应孵育时间的理想范围为10分钟至60分钟内出现亮黄色显色：低于5分钟表明酶活性过高，建议稀释样品，否则影响检测精度；大于60分钟表明酶活性较低，建议增加样品量，不要增加孵育时间
- 如果增加孵育时间3小时以上，可能产生反应底物的自动水解，影响检测精度
- 如果用户样品有限，转染困难，且酶活性过低，必须大量增加孵育时间
- 样品的酶活性吸光值在0.1至1.2 OD单位为理想状态，其酶活性与吸光值成线性正相关；吸光值在0.3至0.9 OD单位为状态
- 亮黄色显色的标准为等同于新鲜的LB培养液作为色彩参照，同时作为反应终止的标准
- 反应终止后，即刻进行比色测定
- 比色测定后，比色皿须清洗*
- 酶活性单位浓度定义：在37℃温度下，每单位酶在单位时间内（每分钟）水解1微摩尔的邻硝基苯基-β-D-半乳糖苷
- 本公司提供系列β-半乳糖苷酶检测试剂产品
质量标准 |
