细胞逆转录酶（REVERSE TRANSCRIPTASE）活性荧光定量检测试剂盒 产品说明书（中文版） 主要用途 细胞逆转录酶（REVERSE TRANSCRIPTASE）活性荧光定量检测试剂是一种旨在通过双链分子底物，在dTTP的参与下，通过逆转录酶的催化，聚合产生RNA-DNA异源双链DNA分子，由PicoGreen特异染色，即采用荧光法来测定细胞裂解样品中酶活性的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种细胞裂解悬液样品（动物、人体、昆虫等）逆转录酶的活性，以及抑制剂检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。 技术背景 逆转录酶（REVERSE TRANSCRIPTASE；EC2.7.7.49），又称为RNA依赖性DNA聚合酶（RNA-dependent DNA polymerase），是将单链RNA分子转录为双链DNA的DNA聚合酶，包括HIV逆转录酶、莫洛尼氏鼠白血病病毒（Moloney murine leukemia virus；MMLV）逆转录酶、禽类成髓细胞瘤病毒（avian myeloblastosis virus；AMV）逆转录酶、端粒酶逆转录酶（omerase reverse transcriptase） 等。逆转录病毒使用逆转录酶达到逆转录RNA为DNA，然后整合到宿主基因组再复制。在真核生物中，端粒酶是一种逆转录酶。逆转录酶在分子生物学中得到广泛运用。检测逆转录酶活性成为病毒感染的监测手段，同时作为药物筛选的靶标。基于由poly-A模板与oligo-dT引物构成的双链分子底物，在dTTP的参与下，通过逆转录酶的催化，聚合产生RNA-DNA异源双链DNA分子（heteroduplexes），由PicoGreen特异染色，根据荧光强度分析（激发波长480nm，散发波长520nm），来定量测定逆转录酶的活性。 产品内容 清理液（Reagent A） | 毫升 | 裂解液（Reagent B） | 毫升 | 缓冲液（Reagent C） | 毫升 | 底物液（Reagent D） | 微升 | 终止液（Reagent E） | 微升 | 染色液（Reagent F） | 微升 | 稀释液（Reagent G） | 毫升 | 标准液（Reagent H） | 微升 | 产品说明书 | 1份 |
保存方式 保存清理液（Reagent A）在4℃冰箱里；其余的保存在－20℃冰箱里；染色液（Reagent F）避免光照；有效保证6月 用户自备 1.5毫升离心管：用于样品保存的容器 15毫升锥形离心管：用于样品制备的容器 细胞刮脱棒：用于细胞脱离 DOUNCE匀浆器：用于裂解组织 台式离心机：用于样品操作 比色皿或酶标板：用于荧光分析的容器 荧光分光光度仪或荧光酶标仪：用于荧光分析 实验步骤 实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的裂解液（Reagent B）置入冰槽里融化。然后进行下列操作。 - 准备好25cm2细胞培养瓶或60mm细胞培养皿的待测培养细胞（1至5 X 106细胞）
- 小心加入xx毫升清理液（Reagent A），覆盖生长表面
- 小心抽去清理液
- 使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞（注意：可以使用胰酶消化）
- 加入xx毫升清理液（Reagent A），混匀细胞
- 移入到预冷的15毫升锥形离心管（注意：悬浮细胞从这一步骤开始）
- 放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为300g
- 小心抽去上清液
- 加入置于冰槽里的xx微升裂解液（Reagent B）
- 强力涡旋震荡30秒，充分混匀
- 即刻放入预冷的DOUNCE匀浆器
- 在冰槽里用匀浆棒匀化组织（约80下）
- 将所有组织匀浆物移入15毫升锥形离心管
- 即刻放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为10000g
- 小心移取上清液到新的无菌的1.5毫升离心管
- 移取10微升进行蛋白定量检测
- 放进－70℃的冰箱里保存或置于冰槽里备用
- 准备好待测样品（例如细胞裂解萃取液或纯化酶样品等），置于冰槽里
- 设定好荧光酶标仪（温度为25℃）：激发波长490nm，散发波长520nm
- 准备好5个1.5毫升离心管，标记为1至5号管
- 分别加入xx微升裂解液（Reagent B）到1至5号管
- 移取xx微升标准液（Reagent H）到1号管，混匀
- 小心移取xx微升1号管稀释的标准液（Reagent H）到2号管，混匀
- 小心移取xx微升2号管稀释的标准液（Reagent H）到3号管，混匀
- 小心移取xx微升3号管稀释的标准液（Reagent H）到4号管，混匀
- 将1至5号管放进冰槽里备用；标准管浓度见下表
管号 | 裂解液（Reagent B） | 标准液（Reagent H） | 测定体系标准DNA浓度 | 1 | xx微升 | xx微升 | xx纳克/毫升 | 2 | xx微升 | xx微升1号管 | xx纳克/毫升 | 3 | xx微升 | xx微升2号管 | xx纳克/毫升 | 4 | xx微升 | xx微升3号管 | xx纳克/毫升 | 5 | xx微升 | 0 | 0 |
三、标准曲线构建 测定开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的染色液（Reagent F）置入冰槽里融化，然后移出2.5微升到新的1.5毫升离心管，加入xx微升稀释液（Reagent G），轻柔混匀后，置于冰槽里，标记为反应工作液（注意：5次操作量），放在暗室里备用。然后进行下列操作 - 在96孔板上做好相应标记：标准样品
- 移取xx微升缓冲液（Reagent C）到96孔板的对应孔里
- 分别加入xx微升底物液（Reagent D）
- 分别加入5微升上述配制的标准液
- 分别加入xx微升终止液（Reagent E）
- 分别加入xx微升染色工作液
- 室温下孵育5分钟，避免光照
- 即刻放进荧光酶标仪检测：获得相对荧光读数RFU（Relative Fluorescence Unit）
- 实际荧光读数：标准样品相对荧光读数－5号管标准样品相对荧光读数（作为背景空对照）
- 构建标准曲线：纵座标（Y轴）为实际荧光单位RFU；横座标（X轴）为标准DNA浓度（纳克/毫升）
四、样品测定 测定开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的染色液（Reagent F）置入冰槽里融化，然后移出2.5微升到新的1.5毫升离心管，加入xx微升稀释液（Reagent G），轻柔混匀后，置于冰槽里，标记为反应工作液（注意：5次操作量），放在暗室里备用。然后进行下列操作 - 在96孔板上做好相应标记：待测样品
- 移取xx微升缓冲液（Reagent C）到96孔板的对应孔里
- 加入xx微升底物液（Reagent D）
- 加入5微升待测样品（注意：10微克纯化酶蛋白或50微克裂解悬液蛋白）
- 室温下孵育60分钟
- 分别加入xx微升终止液（Reagent E）
- 分别加入xx微升染色工作液
- 室温下孵育5分钟，避免光照
- 即刻放进荧光酶标仪检测：获得相对荧光读数RFU（Relative Fluorescence Unit）
- 实际荧光读数：待测样品相对荧光读数－5号管标准样品相对荧光读数（作为背景空对照）
- 根据标准曲线获得样品对应DNA浓度（纳克/毫升）
- 实际活性计算：
注意事项 - 本产品为20次操作
- 操作时，须戴手套
- 系统操作过程中，标准曲线测定只需1次
- 样品须澄清，至关重要
- 样品中避免使用EDTA、EGTA、NaCl、MgCl2、Triton X-100等
- 反应完成后即刻进行荧光测定
- 测定值由低到高变化
- 样本测定样品读数高于背景读数表明具有酶活性
- 待测样本为粗提酶样品，其蛋白浓度为10微克/5微升；待测样本为细胞裂解悬液，其蛋白浓度为50微克/5微升
- 如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度
- 逆转录酶单位活性定义为：在25℃，pH 8.1条件下，每小时内能够转录1纳克DNA所需的酶量作为一个活性单位
- 本公司提供系列逆转录酶检测试剂产品
质量标准 |
