真菌/酵母细胞β1，3- D-葡聚糖合成酶活性定量检测试剂盒 产品说明书（中文版） 主要用途 真菌/酵母细胞β1，3- D-葡聚糖合成酶活性定量检测试剂是一种旨在通过β1，3- D-葡聚糖合成酶反应系统中尿嘧啶核苷-5’-二磷酸葡萄糖底物聚合成葡聚糖，与荧光染料结合产生荧光峰值的变化，来测定样品中酶活性的而经典的技术方法。该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的。其适用于各种真菌或酵母细胞株裂解悬液中β1，3- D-葡聚糖合成酶的活性检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，具有高通量特点。 技术背景 真菌/酵母细胞壁结构具有丰富的糖蛋白外层和碳水化合物内层，包括（1,3）-β-D，（1,6）-β-D和（1,3）-α-D-葡聚糖（glucan）。其中（1,3）-β-D为主要元素。1,3-β-D-葡聚糖合成酶（1,3-β-D-glucan synthase；GS；EC.2.4.1.34），又称为尿嘧啶核苷-5’-二磷酸葡萄糖：1,3-β-葡萄糖基转移酶（UDP-glucose：1,3-β-glucosyl transferase），催化以尿嘧啶核苷-5’-二磷酸葡萄糖（UDP-glucose）为底物，通过1,3-β链接聚合为葡聚糖的反应，构成真菌/酵母细胞壁结构中主要碳水化合物成分1,3-β-D-葡聚糖，为细胞生长所必需。1,3-β-D-葡聚糖合成酶具有两种结构体：1个调节亚体，GTPase Rho1p和4个催化亚体，Bgs1p－4p或Fksp。（1,3）-β-D-葡聚糖合成酶成为抗真菌药物，例如卡泊芬净（caspofungi）等的靶标。基于底物UDP-glucose在葡聚糖合成酶的催化下，聚合成（1,3）-β-D－葡聚糖产物，与苯胺蓝（Aniline blue；4,4-（carbonyl-bis（benzene-4,1- diyl）-bis-（imino）-bis-benzenesulfonic acid）反应产生复合物，呈现荧光峰值的变化（激发波长400nm，散发波长460nm），由此定量测定β1，3- D-葡聚糖合成酶的活性。 产品内容 裂解液（Reagent A） | 毫升 | 强化液（Reagent B） | 毫升 | 缓冲液（Reagent C） | 毫升 | 底物液（Reagent D） | 微升 | 终止液（Reagent E） | 微升 | 反应液（Reagent F） | 毫升 | 稀释液（Reagent G） | 微升 | 标准液（Reagent H） | 微升 | 说明书 | 1份 |
保存方式 保存在－20℃冰箱里；反应液（Reagent F）避免光照；终止液（Reagent E）具有腐蚀性，注意操作安全；有效保证6月 用户自备 15 毫升锥形离心管：用于真菌/酵母细胞收集的容器 1.5 毫升离心管：用于真菌/酵母细胞裂解操作或反应液配制的容器 台式离心机：用于沉淀真菌/酵母细胞 微型台式离心机：用于真菌/酵母细胞裂解悬液澄清 超速离心机：用于微粒体样品制备 恒温培养箱或恒温水槽：用于反应孵育 比色皿或酶标板：用于染色后荧光检测的容器 荧光分光光度仪或荧光酶标仪：用于荧光分析 实验步骤 一、 样品准备 1． 准备好10 毫升待测的新鲜真菌/酵母细胞（OD600＝0.4 至0.8，即1 至2 X 107细胞/毫升） 2． 移入到预冷的15 毫升锥形离心管 3． 置于冰槽里5 分钟 4． 放进4℃台式离心机离心10 分钟，速度为3000g 5． 小心抽去上清液 6． 加入xx 微升裂解液（Reagent A），充分混匀 7． 转移到预冷的1.5 毫升离心管 8． 加入xx 微升强化液（Reagent B）（注意：参见注意事项3） 9． 强力涡旋震荡15 秒 10．置于冰槽里1 分钟 11．重复实验步骤9 至10 五次 12．加入xx 微升裂解液（Reagent A），充分混匀 13．放进4℃微型台式离心机离心10 分钟，速度为1000g（或3500RPM，例如eppendorf 5415） 14．小心移取500 微升上清液到新的预冷的1.5 毫升离心管 15．（选择步骤）如果使用微粒体样品，放进4℃超速离心机离心60 分钟，速度为100000g 16．（选择步骤）小心移取500 微升上清液到新的预冷的1.5 毫升离心管 17．移取 5 微升进行蛋白定量测定（注意：建议使用 Bradford 蛋白质浓度定量试剂盒－ ） 18．即刻放进－70℃保存或置 于冰槽里继续后续操作 二、 测定准备 1． 准备好待测样品（例如细胞裂解萃取液或微粒体样品等），置于冰槽里 2． 设定好荧光分光光度仪或荧光酶标仪（温度为25℃）：激发波长400nm，散发波长460nm，并置零 3． 准备好5 个1.5 毫升离心管，标记为1 至5 号管 4． 分别加入xx 微升稀释液（Reagent G）到2 至5 号管 5． 移取xx 微升标准液（Reagent H）到1 号管，混匀 6． 小心移取xx 微升1 号管稀释的标准液（Reagent H）到2 号管，混匀 7． 小心移取xx 微升2 号管稀释的标准液（Reagent H）到3 号管，混匀 8． 小心移取20微升3号管稀释的标准液（Reagent H）到4号管，混匀 9． 将1至5号管置于室温下备用；标准管浓度见下表 管号 | 稀释液（Reagent G） | 标准液（Reagent H） | 标准葡聚糖浓度 | 1 | ―― | 微升 | 纳摩尔/升 | 2 | 微升 | 微升1号管 | 纳摩尔/升 | 3 | 微升 | 微升2号管 | 纳摩尔/升 | 4 | 微升 | 微升3号管 | 纳摩尔/升 | 5 | 微升 | 0 | 0 |
三、 标准曲线测定 1． 移取xx微升缓冲液（Reagent C）到1.5毫升离心管 2． 加入5微升上述配制的标准液 3． 加入xx微升终止液（Reagent E） 4． 放进80℃恒温培养箱或恒温水槽孵育30分钟，避免干枯 5． 加入xx微升反应液（Reagent F），混匀 6． 放进50℃恒温培养箱或恒温水槽孵育30分钟，避免光照 7． 室温下孵育30分钟，避免光照 8． 转移到比色皿或酶标板 9． 即刻放进荧光分光光度仪检测：获得相对荧光读数 10．重复实验步骤1至9四次 11．构建标准曲线：纵座标（Y轴）为相对荧光单位；横座标（X轴）为标准葡聚糖浓度（纳摩尔/升） 四、 样品测定 1． 移取xx微升缓冲液（Reagent C）到1.5毫升离心管 2． 加入xx微升底物液（Reagent D） 3． 加入xx微升上述制备的待测样品（20微克微粒体蛋白或100微克细胞裂解萃取液蛋白），混匀（注意：样品须清澈） 4． 室温下（25℃）孵育30分钟 5． 加入xx微升终止液（Reagent E） 6． 放进80℃恒温培养箱或恒温水槽孵育30分钟，避免干枯 7． 加入xx微升反应液（Reagent F），混匀 8． 放进50℃恒温培养箱或恒温水槽孵育30分钟，避免光照 9． 室温下孵育30分钟，避免光照 10．转移到比色皿或酶标板 11．即刻放进荧光分光光度仪检测：获得样品相对荧光读数 12．根据标准曲线获得样品对应葡聚糖浓度 五、 计算样品活性 [根据标准曲线获得样品对应葡聚糖浓度（纳摩尔/升）X样品稀释倍数]÷ X xx（分钟）＝皮摩尔/毫升/分钟÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝皮摩尔/毫克/分钟 注意事项 1． 本产品为25次操作，包括标准样 2． 操作时，须戴手套 3． 强化液（Reagent B）为固体状，移取方法为：使用1毫升枪头，将部分剪去；或使用0.5毫升PCR管的盖子内圈盛满；或秤重0.1克 4． 终止液（Reagent E）具有腐蚀性，注意操作安全 5． 建议测定细胞裂解悬液的蛋白浓度，便于计算活性单位之需；建议使用－Bradford蛋白质浓 6． 荧光测定后，比色皿须清洗* 7． 酶活性单位浓度定义：在28℃室温下，pH 7.8的情况下，每单位酶在单位时间内（每分钟）合成1微摩尔的葡聚糖 8． 待测样本为微粒体，其蛋白浓度为20微克/5微升；待测样本为细胞裂解悬液，其蛋白浓度为100至200微克/5微升（本公司提供 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒） 9． 如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度 10．本公司提供系列真菌/酵母细胞酶学相关试剂产品 |
