HL50414.3 v.A

纯化高尔基体UDP半乳糖转移酶（UDP-galactosyl transferase）活性光度法定量检测试剂盒产品说明书

主要用途

纯化高尔基体UDP半乳糖转移酶（UDP-galactosyl transferase）活性光度法定量检测试剂是一种旨在通过底物UDP-半乳糖受到UDP半乳糖转移酶催化后，获得UDP，进而由丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶连续循环法反应系统，伴随的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的氧化反应， 即采用光度法测定其氧化后峰值的变化，以分析样品中酶活性的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种动物、人体细胞或组织分离纯化的高尔基体裂解萃取液样品、部分或*纯化酶样品中UDP半乳糖转移酶的定量检测，以及抑制剂和激活剂的筛选。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，高度敏感。

技术背景

尿苷二磷酸半乳糖转移酶（uridine diphospogalactosyl transferase；beta4GalT ；EC2.4.1.90），全称为尿苷二磷酸-α-D-半乳糖：N-乙酰-D-葡糖胺4-β-D-半乳糖转移酶（UDP-α-D-galactose:N-acetyl-D-glucosamine 4-β-D-galactosyl transferase），又称为β-N-乙酰-D-葡糖胺酰糖肽β-1,4-半乳糖转移酶（β-N-acetylglucosaminyl-glycopeptide β-1,4-galactosyltransferase；EC2.4.1.38）或N-乙酰乳糖胺合成酶（N-acetyllactosamine synthase；EC2.4.1.22），属于糖基转移酶（glycosyltransferase）家属。UDP半乳糖转移酶分成7种4组：1和2；3和4；5和6；以及7，为II型膜结合蛋白，位于高尔基体的反面潴泡（Trans Cisternae）上，成为高尔基体的标志蛋白。其*底物为UDP-半乳糖。其功能在于转移半乳糖以β1,4链接形式到类似糖受体上：N-乙酰糖胺（N-acetylglucosamine）和葡萄糖等，生成不同的结合糖（glycoconjugate）和二糖（乳糖），延长糖蛋白和糖脂的糖链，进行蛋白质处理，而作用于细胞表面和免疫系统。一旦酶功能缺失，将导致先天性糖基化异常疾病（congenital disorder of glycosylation； CDG），出现精神运动性（psychomotor）异常症状和精神发育迟缓等。基于底物UDP-半乳糖和N-乙酰糖胺，在锰离子的存在下，受到UDP半乳糖转移酶的催化，获得产物UDP和N-乙酰乳糖胺（N-acetyllactoamine），进而通过丙酮酸激酶（pyruvate kinase；PK）和乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase；LDH）反应系统中，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）转化为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），其吸光峰值的变化（340nm），来定量分析UDP半乳糖转移酶的活性。其反应方式为：

产品内容

缓冲液（Reagent A）  毫升

酶促液（Reagent B）  微升

反应液（Reagent C）  微升

底物液（Reagent D）  微升

阴性液（Reagent E）  微升

产品说明书  1份

保存方式

保存在－20℃冰箱里，避免光照和反复冻融；有效保证6月

用户自备

200微升1厘米光径比色皿或96孔板：用于光度分析操作的容器

分光光度仪或酶标仪：用于样品光度分析

实验步骤

• 测定准备

• 准备好待测样品（例如纯化高尔基体裂解悬液等），置于冰槽里 
• 设定好分光光度仪（温度为30℃）：波长为340nm，间隔2分钟，读数6次（共10分钟），并置零
• 缓冲液（Reagent A）室温下均衡温度

• 背景对照测定

• 移取xx微升缓冲液（Reagent A）到新的比色皿
• 加入xx微升酶促液（Reagent B）
• 加入xx微升反应液（Reagent C）
• 加入xx微升底物液（Reagent D）
• 放进30℃培养箱里静置3分钟
• 加入xx微升阴性液（Reagent E）
• 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
• 即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照：340波长读数0分钟 －340波长读数10分钟

• 样品测定

• 移取xx微升缓冲液（Reagent A）到新的比色皿
• 加入xx微升酶促液（Reagent B）
• 加入xx微升反应液（Reagent C）
• 加入xx微升底物液（Reagent D）
• 放进30℃培养箱里静置3分钟
• 加入10微升待测样品（注意：20微克高尔基体裂解蛋白；样品须溶解）
• 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
• 即刻放进分光光度仪检测，此为样品总活性读数：340波长读数0分钟 －340波长读数10分钟

• 计算样品活性

• 酶标仪测定

• 在96孔板上做好相应标记：背景对照和样品
• 分别移取xx微升缓冲液（Reagent A）到96孔板里
• 分别加入xx微升酶促液（Reagent B）
• 分别加入xx微升反应液（Reagent C）
• 分别加入xx微升底物液（Reagent D）
• 轻轻摇动96孔板
• 在30℃温度下孵育3分钟
• 分别加入xx微升阴性液（Reagent E）或待测样品（20微克高尔基体裂解悬液蛋白）到相应孔里（注意：样品须清澈）
• 轻轻摇动96孔板
• 即刻放进酶标仪检测：0分钟读数和10分钟读数
• 活性计算：

注意事项

• 本产品为20次操作，包括背景操作
• 操作时，须戴手套
• 系统操作过程中，背景测定只需1次
• 样品须澄清，至关重要 
• 加入样品启动反应后3秒内即刻光度测定
• 测定值由高到低变化；测定可持续30分钟
• 光度测定后，比色皿须清洗*
• 样本测定0分钟读数高于10分钟读数表明具有酶活性
• 建议待测样本蛋白浓度为20微克/10微升（本公司提供  Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－30030.1）
• 如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度
• UDP半乳糖转移酶活性单位浓度定义：在30℃温度下，pH 8.0条件下，每分钟内能够氧化1微摩尔还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作为一个活性单位
• 本公司提供系列糖基转移酶检测试剂产品

质量标准

• 本产品经鉴定性能稳定
• 本产品经鉴定检测敏感