HL50259.4 v.A

细菌苹果酸脱氢酶（MDH）活性光度法定量检测试剂盒产品说明书

主要用途

细菌苹果酸脱氢酶（MDH）活性光度法定量检测试剂是一种旨在通过苹果酸脱氢酶反应系统中还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）氧化后峰值的降低，即采用光度法来测定细菌裂解萃取样品中酶活性的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种细菌细胞裂解样品例如紫色光能利用细菌（Purple phototropic）、嗜冷性细菌（psychrophilic）、嗜盐性细菌（halophilic）等苹果酸脱氢酶的活性检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。

技术背景

苹果酸脱氢酶（Malate dehydrogenase；MDH；EC1.1.1.37），又称为苹果酸NAD氧化还原酶（L-Malate:NAD⁺ oxidoreductase），是柠檬酸循环（citric acid cycle）中酶之一，为氧化还原酶，催化苹果酸和草酰乙酸（oxaloacetate）的互相转化反应，氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD）作为辅因子。同时参与非糖物质小分子转变为葡萄糖或糖原糖异生（gluconeogenesis）作用。苹果酸脱氢酶存在于所有真核细胞中，有2种同工酶：线粒体型（M型）和胞浆型（S型），由2个相同的亚体构成，每个亚体分子量为35KD。细菌苹果酸脱氢酶分成两类：小分子量和大分子量。前者为60至65Kd分子量，同源二聚体，包括大肠杆菌（E. Coli）、绿脓杆菌等革兰氏阴性菌，与真核生物，尤其是线粒体型类同；后者为117至146Kd分子量，同源四聚体，包括杆菌（Bacillus）、嗜热细菌（Thermoactinomyces）、古细菌（Archaebacteria）等。碘化物，例如甲状腺素（Thyroxine）、碘（iodine）、等抑制苹果酸脱氢酶活性；而磷酸盐、砷酸盐（arsenate）和锌离子可以激活苹果酸脱氢酶。基于草酰乙酸在苹果酸脱氢酶的催化下，逆转化为苹果酸，同时还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）转化为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），其吸光值的变化（340nm 波长），来定量测定苹果酸脱氢酶的活性。苹果酸脱氢酶反应系统为：

产品内容

裂解液（Reagent A） 毫升

活性液（Reagent B）   微升

缓冲液（Reagent C） 毫升

反应液（Reagent D）   毫升

底色液（Reagent E） 毫升

阴性液（Reagent F）   微升

产品说明书 1份

保存方式

保存活性液（Reagent B）、反应液（Reagent D）和底色液（Reagent E）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里，底色液（Reagent E）避免光照，有效保证6月

用户自备

1.5毫升离心管：用于样品保存的容器

15毫升锥形离心管：用于样品制备的容器

超声仪：用于裂解细菌细胞

（微型）台式离心机：用于样品制备

比色皿或96孔板：用于光度的容器

分光光度仪或酶标仪：用于光度分析

实验步骤

• 样品准备

• 准备好10毫升待测的细菌放进37℃摇床孵育16小时，速度为220RPM
• 直至OD600＝0.4至0.8，即1至2 X 10⁷细胞/毫升
• 置于冰槽里5分钟
• 放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为1000g
• 小心抽去上清液
• 加入xx微升裂解液（Reagent A），充分混匀
• 转移到预冷的1.5毫升离心管
• 加入xx微升活性液（Reagent B）
• 强力涡旋震荡15秒
• 置于超声仪下超声裂解处理：100瓦功率，20秒一次，间隔2分钟，重复4次
• 放进4℃微型台式离心机离心20分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管
• 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－30030.1）
• 即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作

• 测定准备

• 准备好待测样品（例如细菌裂解样品等），置于冰槽里
• 设定好分光光度仪（温度为25℃）：波长340nm，间隔30秒，读数6次（共3分钟），并置零 
• 缓冲液（Reagent C）室温下均衡温度

• 背景对照测定

• 移取xx微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入xx微升反应液（Reagent D）
• 加入xx微升底色液（Reagent E）
• 上下倾倒数次，混匀
• 在25℃温度下孵育5分钟
• 加入xx微升阴性液（Reagent F）
• 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
• 即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照（0分钟读数－3分钟读数） 

• 样品测定

• 移取xx微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入xx微升反应液（Reagent D）
• 加入xx微升底色液（Reagent E）
• 上下倾倒数次，混匀
• 在25℃温度下孵育5分钟
• 加入20微升待测样品（20微克蛋白）（注意：样品须清澈）
• 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
• 即刻放进分光光度仪检测，此为样品读数（0分钟读数－3分钟读数） 

• 计算样品活性

六、酶标仪测定

• 在96孔板上做好相应标记：背景对照和样品
• 分别移取xx微升缓冲液（Reagent C）到相应孔里 
• 分别加入xx微升反应液（Reagent D）
• 分别加入xx微升底色液（Reagent E）
• 轻轻摇动96孔板
• 在25℃温度下孵育5分钟
• 分别加入xx微升阴性液（Reagent F）或待测样品（20微克蛋白）（注意：样品须清澈）
• 轻轻摇动96孔板
• 即刻放进酶标仪检测，包括（0分钟读数和3分钟读数）
• 活性计算

注意事项

• 本产品为20次（比色皿）和80次（96孔板）操作，包括背景对照
• 操作时，须戴手套
• 系统操作过程中，背景测定只需1次
• 样品须澄清，至关重要 
• 加样后3秒内光度测定
• 反应1分钟后光度测定值趋于稳定；测定值由高到低变化；测定可持续3分钟
• 光度测定后，比色皿须清洗*
• 背景空对照0分钟读数通常0.2至0.8为理想状态
• 背景空对照的正常读数差值（0分钟－3分钟）通常为0.001至0.005（正负即可）
• 样品0分钟读数通常和背景空对照0分钟读数一致
• 样本测定3分钟读数低于0分钟读数表明具有酶活性
• 建议待测样本蛋白浓度为20微克/20微升；如果样本酶活性过低或过高， 则可以增加或降低样本量（本公司提供  Bradford蛋白质浓度定量试剂盒30030.1）
• 如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度
• 苹果酸脱氢酶（MDH）单位活性定义为：在25℃，pH 7.4条件下，每分钟内能够转化1微摩尔草酰乙酸和NADH至苹果酸和NAD所需的酶量作为一个活性单位
• 本公司提供系列苹果酸脱氢酶学检测试剂产品

质量标准

• 本产品经鉴定性能稳定
• 本产品经鉴定检测敏感