HL50713.1 v.A 植物查尔酮合成酶（chalcone synthase）活性比色法定量检测试剂盒产品说明书 主要用途 植物查尔酮合成酶（chalcone synthase）活性比色法定量检测试剂是一种旨在通过香豆酰辅酶A和丙二酰辅酶A缩合反应系统中释放出巯基辅酶A，使用Ellman试剂后，产生黄色5-巯基-2-硝基苯甲酸产物吸光峰值的变化，即采用比色法来测定植物裂解样品中酶活性的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适合于各种植物组织，包括种子（seed）、叶片（leaf）、根（root）、胚胎叶（cotyledon）、上胚轴（epicotyl）等查尔酮合成酶的活性检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。 技术背景 查尔酮合成酶（chalcone synthase；CHS；EC2.3.1.74）是聚酮体合成酶（polyketide synthase；PKS）大家属中的一员，是启动类黄酮（flavonoid）化合物合成通路中*步关键酶，形成植物系统性获得性抗性（systematic acquired resistance；SAR）的基础。查尔酮合成酶存在于细菌、植物和真菌中。在所有裸子植物（gymnosperm）和被子植物（angiosperm）的各种不同发育阶段中的不同组织中表达。查尔酮合成酶为同源二聚体，分子量为40至4000Kd，由环境压力，包括UV照射、伤口、病原菌袭击等诱导，通过丙二酰辅酶A脱羧基反应（decarboxylation）、与香豆酰辅酶缩合、聚酮体链延展（chain elongation）、中间产物环状化（cyclization）和芳构化（aromatization）产生查尔酮，一种类黄酮化合物前体，作为化学信使，由此生成各种后续继发性代谢化合物，参与抗病原微生物例如异黄酮植物保护素（isoflavonoid phytoalexin）、花青素花色素化、抵御环境压力（UV光保护）、花粉育性（pollen fertility）、抗氧化、共生根系结瘤（symbiotic root nodulation），以及作为抗生素、免疫抑制剂、抗肿瘤和抗真菌的药物作用。还在细菌的囊肿形成和阿米巴细胞分化中产生作用。基于香豆酰辅酶A和丙二酰辅酶A，在敏感性抑制剂木犀草素（Luteolin）存在与否的情况下，受到查尔酮合成酶的作用，缩合产生查尔酮，并释放出巯基辅酶A（CoA-SH），进而与Ellman试剂5,5-二硫基-双（2-硝基苯甲酸）[5,5,-dithiobis-（2-nitrobenzoic acid）；DTNB]反应后，产生黄色的5-巯基-2-硝基苯甲酸（5-thio-2-nitrobenzoic acid；TNB），通过其吸收峰值的变化（412nm波长），来定量分析查尔酮合成酶的活性。查尔酮合成酶反应系统为： 产品内容 清理液（Reagent A） 毫升 裂解液（Reagent B） 毫升 缓冲液（Reagent C） 毫升 反应液（Reagent D） 毫升 底物液（Reagent E） 毫升 专性液（Reagent F） 微升 产品说明书 1份 保存方式 保存缓冲液（Reagent C）、反应液（Reagent D）和底物液（Reagent E）在－20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里；反应液（Reagent D）和底物液（Reagent E）避免光照；有效保证6月 用户自备 1.5毫升离心管：用于样品操作的容器 15毫升锥形离心管：用于样品制备的容器 DOUNCE匀浆器：用于裂解组织细胞 微型台式离心机：用于样品操作 200微升1厘米光径比色皿或96孔板：用于比色的容器 分光光度仪或酶标仪：用于比色分析 实验步骤 - 准备好新鲜的植物组织（叶片、谷粒、种子等），并秤重以确定1克组织重量
- （选择步骤）放进预冷的15毫升锥形离心管
- （选择步骤）加入xx毫升清理液（Reagent A）清洗1次
- 即刻用刀片切碎组织
- 放进一个预冷的15毫升锥形离心管
- 加入预冷的xx毫升裂解液（Reagent B）
- 涡旋震荡5秒，充分混匀
- 即刻放进预冷的DOUNCE匀浆器，在冰槽里用匀浆棒匀化组织（约80下）
- 将所有组织匀浆物移入1.5毫升离心管，放进4℃微型台式离心机离心10分钟，速度为5000g（或7500RPM，例如eppendorf 5415）
- 小心移出上清液（注意：不要触碰沉淀物）到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管
- （选择步骤）如果上清液含有肉眼可见的残渣，重复离心5分钟一次，速度为5000g（或7500RPM，例如eppendorf 5415）
- 即刻移入到1.5毫升离心管
- 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－30030.1）
- 放进－70℃的冰箱里保存或置于冰槽里备用
- 开启并设定好分光光度仪（温度为30℃）：波长412nm，间隔5分钟，读数7次（共30分钟），并置零
- 从－20℃冰箱里取出试剂，置于冰槽里融化；反应液（Reagent D）和底物液（Reagent E）避免光照；缓冲液（Reagent C）室温下预热
- 移取xx微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
- 加入xx微升底物液（Reagent E）
- 在30℃温度下孵育3分钟
- 加入20微升待测样品（200微克蛋白）（注意：样品须清澈）
- 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
- 即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照（30分钟读数－0分钟读数）
- 移取xx微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
- 加入xx微升反应液（Reagent D）
- 加入xx微升底物液（Reagent E）
- 上下倾倒数次，混匀
- 在30℃温度下孵育3分钟
- 加入20微升待测样品（200微克蛋白）（注意：样品须清澈）
- 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
- 即刻放进分光光度仪检测，此为样品读数（30分钟读数－0分钟读数）
检测开始前，分别移取xx微升专性液（Reagent F）和待测样品（注意：200微克蛋白）到1.5毫升离心管，混匀后，放进30℃培养箱里孵育15分钟。然后继续下列操作。 - 移取xx微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
- 加入xx微升反应液（Reagent D）
- 加入xx微升底物液（Reagent E）
- 上下倾倒数次，混匀
- 在30℃温度下孵育3分钟
- 加入40微升上述预处理的待测样品
- 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
- 即刻放进分光光度仪检测，此为样品读数（30分钟读数－0分钟读数）
六、计算样品活性 2）样品特异活性计算 1）样品总活性测定 - 在96孔板上做好相应标记：背景对照和待测样品
- 分别移取xx微升缓冲液（Reagent C）到96孔板的所有孔里
- 加入xx微升缓冲液（Reagent C）到背景对照孔里
- 加入xx微升反应液（Reagent D）到待测样品孔里
- 分别加入xx微升底物液（Reagent E）到96孔板的所有孔里
- 在30℃温度下孵育3分钟
- 分别加入20微升待测样品（200微克蛋白）到96孔板的所有孔里（注意：样品须清澈）
- 轻轻摇动96孔板
- 即刻放进酶标仪检测：0分钟读数和30分钟读数数
- 活性计算：
2）样品非特异活性测定 检测开始前，分别移取xx微升专性液（Reagent F）和待测样品（注意：200微克蛋白）到1.5毫升离心管，混匀后，放进30℃培养箱里孵育15分钟。然后继续下列操作。 - 在96孔板上做好相应标记：待测样品
- 移取xx微升缓冲液（Reagent C）到96孔板的孔里
- 加入xx微升反应液（Reagent D）
- 加入xx微升底物液（Reagent E）
- 在30℃温度下孵育3分钟
- 加入40微升上述预处理的待测样品
- 轻轻摇动96孔板
- 即刻放进酶标仪检测：0分钟读数和30分钟读数数
- 活性计算：
注意事项 - 本产品为20次操作
- 操作时，须戴手套
- 建议使用比色皿测定
- 样品须澄清，至关重要
- 加样后3秒内比色测定
- 测定值由低到高变化；测定可持续60分钟
- 比色测定后，比色皿须清洗*
- 样本测定30分钟读数高于0分钟读数表明具有酶活性
- 如果待测样本为总蛋白，其蛋白浓度为200微克/20微升（本公司提供 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－30030.1）
- 如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度
- 查尔酮合成酶单位活性定义为：在30℃，pH 7.8条件下，每分钟内能够释放1微摩尔辅酶A所需的酶量作为一个活性单位
- 本公司提供系列聚酮体代谢检测试剂产品
质量标准 |
