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组织总抗氧化能力(TAC)比色法(DPPH)定量检测试剂盒
点击次数:648 更新时间:2023-05-08

组织总抗氧化能力(TAC)比色法(DPPH)定量检测试剂盒产品说明书

 

主要用途

 

组织总抗氧化能力(TAC)比色法(DPPH)定量检测试剂是一种旨在通过有机氮自由基染料DPPH的参与,在抗氧化剂的存在下,通过分光光度仪,观察其峰值下降的变化,来定量检测对应于标准水溶性生育酚Trolox总抗氧化能力,即消除自由基等值浓度的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。适用于各种新鲜组织(动物、人体、植物、昆虫等)的总抗氧化能力检测。可以被用于细胞凋亡、衰老、代谢和营养学等的研究产品严格无菌,即到即用,操作简易,性能稳定。

 

技术背景

 

超氧自由基阴离子superoxide radicalO2-)、过氧化氢(hydrogen peroxideH2O2)、羟自由基或氢氧基hydroxyl radicalOH-)、过氧化基(peroxyl radicalROO-)、氢过氧自由基(hydroperoxylHOO)、烷氧自由基(alcoxyl radical)、氮氧基(nitric OxideNO-、过氧亚硝基阴离子(peroxynitrite anionONOO-次氯酸(hypocorous acidHOCl)、半醌自由基semiquinone radical)、单线态氧气(singlet oxygen)等细胞内活性氧族(Reactive Oxygen SpeciesROS)的产生和增多,将导致细胞衰老或凋亡,甚而导致诸如冠心病、风湿性关节炎、肿瘤、退行性病变等各种病理状况。在生物系统内,通过抗氧化酶例如超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和过氧化物酶等,大分子,例如白蛋白、铜蓝蛋白(ceruloplasminCER)、铁蛋白(ferritin)和抗氧化因子,例如生育醇、类胡萝卜素、抗坏血酸、还原性和尿酸(bilirubin)等,产生抗氧化能力,即捕获自由基的能力,达到消除或降低ROS的损害。通过稳定的有机氮自由基染料1,1-二苯基-2-三硝基苯肼1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazylradicalDPPH),受到抗氧化剂的去自由基作用,呈现深紫色转化为黄色的变化,衡量体系中抗氧化剂捕获自由基、消耗抗氧化剂的能力,在分光光度仪(515nm波长)的帮助下,观察其峰值下降的变化,并与标准化抗氧化剂水溶性生育酚Trolox对照。

 

产品内容

 

清理液(Reagent A                     250毫升

低渗液(Reagent B                      25毫升

缓冲液(Reagent C                      20毫升

染色液AReagent D1                      1

染色液BReagent D2                     10毫升

标准液(Reagent E                     200微升

产品说明书                 1

 

保存方式

 

保存清理液(Reagent A4冰箱里,其余的保存在-20冰箱里,有效保证6

 

 

 

用户自备

 

15毫升锥形离心管:用于组织样品操作的容器

2毫升离心管:用于组织样品操作的容器

1.5毫升离心管:用于组织裂解悬液存放的容器

4微型台式离心机:用于样品操作

超声仪:用于破碎组织细胞

200微升1厘米光径比色皿或96孔板:用于比色的容器

分光光度仪或酶标仪:用于比色分析

 

实验步骤

 

一、 样品准备

 

1. 手术取出动物组织,并秤重以确定组织重量200毫克

2. 移入到一个液氮冻存管

3. 即刻放进液氮罐过夜

4. 次日从液氮罐里取出,即刻(最快速度)用研磨棒碾碎组织成粉末状(注意:切莫使组织冻融

5. 放进一个15毫升锥形离心管

6. 加入2毫升4预冷的 清理液(Reagent A

7. 强力涡旋震荡30秒,充分混匀

8. 转移到4预冷的2毫升离心管

9. 放进4微型台式离心机离心10分钟,速度为400g(或2000RPM,例如eppendorf 5415

10. 小心抽去上清液

11. 加入1毫升4预冷的 清理液(Reagent A,混匀

12. 放进4微型台式离心机离心10分钟,速度为400g(或2000RPM,例如eppendorf 5415

13. 小心抽去上清液

14. 重复实验步骤1113二次

15. 加入500微升低渗液(Reagent B),混匀

16. 置于200瓦超声仪枪头下,离心管在冰槽里

17. 超声功率为100%,猝击10秒,2个循环

18. 放进4微型台式离心机离心10分钟,速度为10000g(或10000RPM,例如eppendorf 5415

19. 移取上清液到新的4预冷的1.5毫升离心管

20. 移取10微升进行蛋白定量检测(建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒-30030.1

21. 使用清理液(Reagent A调整蛋白浓度为100微克/10微升

22. 置于冰槽里待测

 

二、标准液准备

 

1. 准备好51.5毫升离心管,标记为15号管

2. 分别加入50微升缓冲液(Reagent C25号管

3. 移取100微升标准液(Reagent E1号管,混匀

4. 小心移取50微升1号管的标准液(Reagent E2号管,混匀

5. 小心移取50微升2号管稀释的标准液(Reagent E3号管,混匀

6. 小心移取50微升3号管稀释的标准液(Reagent E4号管,混匀

7. 15号管放进冰槽里备用,避免光照;标准管浓度见下表

 

管号

缓冲液(Reagent C

标准液(Reagent E

测定体系

标准 Trolox浓度

1

0

100微升

80微摩尔/

2

50微升

50微升

40微摩尔/

3

50微升

50微升

20微摩尔/

4

50微升

50微升

10微摩尔/

5

50微升

0

0

 

三、 样品测读

 

实验开始前,将-20冰箱里的试剂置于室温下融化,移取5毫升染色液BReagent D21染色液AReagent D1里,混匀,置于暗室里,标记为染色工作液避免光照。然后进行下列操作。

 

1. 准备196孔板,做好标记:空白对照孔、标准样品孔、待测样品孔

2. 分别移取205微升缓冲液(Reagent C96孔板里的每个孔里

3. 分别加入25微升染色工作液 

4. 加入20微升缓冲液(Reagent C空白对照孔

5. 加入20微升上述配制的标准液(Reagent E到相应标准样品孔里

6. 加入20微升样品(100微克蛋白总量)到待测样品孔里

7. 轻轻摇动96孔板,使其混匀

8. 室温下孵育15分钟

9. 即刻放进酶标仪里测读:515nm波长

10. 分析结果:

1) 构建标准曲线:纵座标(Y轴)为吸光单位(OD515nm);横座标(X轴)为标准Trolox浓度(微摩尔/升)

2) 空白对照孔为最大吸光单位(OD515nm)读数

3) 标准样品孔和待测样品孔为实际吸光单位(OD515nm)读数

4) 根据标准曲线获得样品对应Trolox浓度(微摩尔/升)

5) 计算样品实际总抗氧化能力

【根据标准曲线获得样品对应Trolox浓度(微摩尔/升)×0.25(体系容量:毫升)×样品稀释倍数÷0.02(样品容量:毫升)=(微摩尔/TROLOX等值)

6) 根据下列公式计算测定体系中样品量的总抗氧化能力(实际抑制百分率)

【(空白对照孔吸光单位读数-实际吸光单位读书)÷空白对照孔吸光单位读数×100

7) IC50:50%抑制率所需的样品单位:TROLOX等值或样品蛋白量(毫克/毫升)或样品容量(微升)

X(所需样品单位)=(已知样品单位÷实际抑制百分率)×50

 

 

注意事项

 

1. 本产品为50次操作,包括标准品

2. 本产品测试范围为10100微摩尔Trolox等值

3. 操作时,须戴手套

4. 样品制备的所有操作均须在4℃状态下进行

5. 用户可以调整标准曲线区间

6. 测试前,样品须新鲜收集

7. 样品须清澈

8. 空白对照孔的吸光读数应为1.0左右为佳

9. 样品读数越低,抗氧化能力越高

10. 可以使用比色皿检测

11. 如果样品抗氧化剂浓度过高或过低, 建议稀释或增加样品容量或浓度

12. 建议待测样本的蛋白浓度为100微克/20微升(本公司提供  Bradford蛋白质浓度定量试剂盒30030.1

13. 如果测试样品很多,建议使用排枪移液

14. 本公司提供系列抗氧化分析试剂产品

 

质量标准

 

1. 本产品经鉴定性能稳定

2. 本产品经鉴定检测敏感


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