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DNase I 溶液 说明书
点击次数:357 更新时间:2023-04-14

产品简介

DNase I ,   即 Deoxyribonuclease I    即脱氧核糖核酸酶 I  是一种可以消化单链或双链 DNA 生单脱氧核苷酸或单链或双链的寡脱氧核苷酸的核酸内切酶。DNase I 水解单链或双  DNA 后的产物, 5'端为磷酸基团,3'端为羟基。

DNase I 性依赖于钙离子,   并能被镁离子或二价锰离子激活 。镁离子存在条件下, DNase I 可随机剪切双链 DNA 的任意位点;二价锰离子存在条件下,DNase I  可在同一位点 剪切 DNA 双链,成平末端, 1 -2 个核苷酸突出的粘末端。

特点: RNase (RNase free), 可以用于各种 RNA 样品的处理 。提供了用于 DNase I 失活所需的 EDTA

用途:制备不含 DNA  RNA 样品;RT -PCR 反应前 RNA 样品中去除基因组 DNA   DNA 污染;体外 T7, T3, SP6 等 RNA Polymerases 催化的 RNA 转录后去除 DNA 模板; DNase I footprinting 研究 DNA -蛋白质相互作用; 缺口平移(nicktranslatioin);  产生 DNA  机片段文库; 细胞凋亡 TUNEL 检测中部分剪切基因组 DNA 作为阳性对照。

来源:从牛胰腺纯化得到 。分子量:  32kDa(单体)。

活性定义:37°C 10 分钟内,将能够降解 1 μg pBR322 质粒 DNA 所需的酶量定义为 1 个活性单位。

活性检测条件:40mM Tris -HCl (pH8.0) , 10mM MgSO4, 1mM CaCl2 , 1 μg of pBR322 DNA 度:不含其它 DNA 内切酶和外切酶,不含 RNA 酶。

保存条件

-20°C 保存 一年内有效。

操作流程

1 RT -PCR 反应前 RNA 样品中 DNA 的去除:

1.1 DNA 模板限制性核酸内切酶作用后线性化。酚/氯仿和氯仿/异丙醇提取 DNA,用乙醇沉 淀后, 溶于适量的无菌去离子水中

1.2  向一无 RNA 酶的 EP 管中依次加入下列试剂:

RNA

1 μg

应缓冲液(10×)

1 μl

 


 

 

充经 DEPC 处理的去离子水

 9 μl

DNase I (1Ul)

1 μl

注意:如需处理较大量的 RNA 样品, 可以按照比例放大上述反应体系 。如果能在上述反应 体系中加入适量 Ribonuclease inhibitor 以防止 RNA 降解则更佳

1.3 37°C 孵育 30min

1.4  向上述反应体系中加入 1 μl 25mM EDTA,65°C 孵育 10min,   以失活 DNase I 。注意:在 没有合剂如 EDTA 等存在情况下加热, RNA 可被水解。

1.5  上述加热处理过的 RNA 样品即可直接用于处理好的 RNA 可用作 RT -PCR 反应的模板。

2 体外 RNA 反转录后模板 DNA 的去除:

2.1  在每含有 0.5 μg  DNA 的反转录反应体系中加入 1U DNase I 。注意:在某些情况下,  DNA消化所需的 DNase I 的量需通过实验进行摸索。

2.2 37°C  孵育 15min

2.3  酚/氯仿抽提失活 DNase I

3  缺口平移进行 DNA 标记

3.1  参考如下表格设置反应:

Reaction Buffer (10×) for DNA Polymerase I

2.5 μl

3 dNTP Mixture (1mM each, without the labeled dNTP) *

1.25μl

[α -32P]-dNTP, ~110TBq/mmol (3000Ci/mmol)

1.85 -3.7MBq (50 -100μ Ci)

DNase I (freshly diluted to 0.002Ul)**

1 μl

DNA Polymerase I, E.coli

0. 5 -1.5 μl (5 -15U)

Template DNA

0.25μg

充无核酸酶去离子水

 25μl

* 3 dNTP Mixture (1mM each, without the labeled dNTP):分别取除已经标记的 dNTP 外的 3  dNTP(100mM)  各 1 μl  加入到 97μl  的无核酸酶的去离子水中混匀即可 。例如标记的为 dATP,则需混合 dTTPdCTP  dGTP 三种 dNTP 至每种的最终浓度为 1mM。配好的 dNTP 可存放于 -20°C 以备后续使用。

** DNase I 可以用 1 ×  Reaction Buffer for DNA Polymerase I 进行稀释。

Reaction Buffer (10 ×) for DNA Polymerase I    500mM Tris -HCl (pH7.5 at 25°C) ,   100mM MgCl2 , 10mM DTT。

3.2  立即 15°C 孵育 15~60min

3.3  上述反应体系中加入l 0.5M EDTA(pH 8.0)终止反应。

3.4  从中取出少量例如 1 μl 检测标记效率 。通常标记效率至少可以达到 108cpmg DNA

3.5  可用 Sephadex G -50 或 Bio -Gel P -60 去除[α -32P]-dNTP   以纯化获得标记的 DNA

馨提示:

了您的自身安全,使用试剂前,请做好防护,如穿实验服, 带手套等。


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