HL50607.2 v.A

组织γ分泌酶（γ-SECRETASE）活性荧光共振能量转移法（FRET）定量检测试剂盒产品说明书

主要用途

组织γ分泌酶（γ-SECRETASE）活性荧光共振能量转移法（FRET）定量检测试剂是一种旨在通过荧光探针NMA供体和DNP受体双重标记的多肽底物，在γ分泌酶的水解作用下，释放出强烈荧光的NMA，而发生荧光峰值的变化，即采用荧光共振能量转移法来测定样品中酶活性的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种组织裂解萃取液样品（动物、人体）、部分或*纯化酶样品中γ分泌酶活性的定量检测，以及抑制剂和激活剂的筛选。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，安全可靠。

技术背景

γ分泌酶（γ-SECRETASE；EC3.4.24.81），是一种多亚体蛋白酶复合物（multisubunit protease complex），由4种蛋白组成：早老素蛋白（Presenilin；PS）、呆蛋白（nicastrin）、前咽缺陷蛋白-1（anterior pharynx defective 1；APH1）和早老素增强蛋白2（presenilin enhancer 2）。其为整合性跨膜蛋白，在早期内质网里组装和成熟，后期内质网进行目标蛋白切离。γ分泌酶切离由β分泌酶切离淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein；APP）产生C99和α分泌酶切离的C83片段，前者成为具有神经毒性的40至42氨基酸长的淀粉样β-多肽（amyloid-β peptide；Aβ）， 是阿茨罕默疾病（alzheimer disease；AD）的病理变化（淀粉样斑；amyloid plaque）的主要成分，由此γ分泌酶成为阿茨罕默疾病治疗的抗淀粉样多肽药物靶标。γ分泌酶与NOTCH调节有关。 基于底物多肽Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala-Thr-Val（源于淀粉样淀粉样β-多肽前体蛋白序列708-715），通过荧光共振能量转移法（Fluorescence resonance energy transfer；FRET），即传递激发状态的能量由处于较短波长的供体（donor）到覆盖供体波长的受体（acceptor），使得距离依赖性反应的供体的散发光子淬灭（quench），使用2个荧光探针N-甲基氨茴酰NMA（N-Methyl-anthraniloyl）供体和二硝基苯基DNP（2,4-Dinitrophenyl）受体作为FRET对，来标记的γ分泌酶选择性多肽底物的两端，在γ分泌酶的水解作用下，在丙氨酰（alaninyl）和苏氨酰（threoninyl）残基处切离，释放出强烈荧光的NMA，在荧光分光光度仪下（激发波长340-360nm，散发波长440-450nm），来定量测定γ分泌酶的活性。其反应系统为：

产品内容

清理液（Reagent A）         毫升

裂解液（Reagent B）         毫升

缓冲液（Reagent C）         毫升

底物液（Reagent D）         微升

标准液（Reagent E）              微升

产品说明书                1份

保存方式

保存清理液（Reagent A）在4℃冰箱里，其余的保存在－20℃冰箱里；底物液（Reagent D）和标准液（Reagent E）避免光照，有效保证6月

用户自备

γ分泌酶：用于抑制剂筛选

1.5毫升离心管：用于标准样品操作和样品保存的容器

15毫升锥形离心管：用于样品操作的容器

（微型）台式离心机：用于细胞预处理

黑色96孔板：用于荧光分析的容器

荧光酶标仪：用于荧光分析

实验步骤

实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂置入冰槽里融化。然后进行下列操作。

一、样品准备

1． 手术取出动物组织，并秤重以确定500毫克组织重量 

2． （选择步骤）放进预冷的15毫升锥形离心管

3． （选择步骤）加入xx毫升清理液（Reagent A）清洗1次

4． 移入到一个液氮冻存管

5． 即刻放进液氮罐过夜

6． 次日从液氮罐里取出，即刻（最快速度）用研磨棒碾碎组织成粉末状（注意：切莫使组织冻融）

7． 放进一个15毫升锥形离心管

8． 加入预冷的xx微升裂解液（Reagent B） 

9． 转移到预冷的1.5毫升离心管

10． 强力涡旋震荡30秒，充分混匀

11． 置于冰槽里孵育30分钟，期间每10分钟强力涡旋震荡30秒（注意：如需暂时停止，放进－70℃冰箱里储存备用）

12． 放进4℃微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）

13． 小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管

14． 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－30030.1）

15． 即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作

二、 测定准备

1． 准备好待测样品（例如组织裂解萃取液或纯化酶样品等），置于冰槽里

2． 设定好荧光酶标仪（温度为37℃）：激发波长355nm，散发波长440nm，增益倍数100至200，间隔10分钟，读数7次（共60分钟） 

3． 准备好5个1.5毫升离心管，标记为1至5号管

4． 加入xx微升缓冲液（Reagent C）到1号管

5． 分别加入xx微升缓冲液（Reagent C）到2至5号管

6． 移取xx微升标准液（Reagent E）到1号管，混匀