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细胞胱硫醚-γ-裂解酶活性光度法定量检测试剂盒产品说明书
点击次数:492 更新时间:2022-12-05


 

细胞胱硫醚-γ-裂解酶活性光度法定量检测试剂盒产品说明书

 

主要用途

 

细胞胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionine γ-lyaseCGL)活性光度法定量检测试剂是一种旨在运用胱硫醚作为底物,在裂解酶的催化下,产生半使用Ellman试剂,呈现黄色5-巯基-2-硝基苯甲酸产物吸光峰值的变化,即采用光度法来测定细胞裂解样品中酶活性的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的其适用于各种细胞裂解悬液或纯化酶样品胱硫醚-γ-裂解的活性检测,以及抑制剂筛选。产品严格无菌,即到即用,操作简捷,性能稳定。

 

技术背景

 

胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionine γ-lyaseCGLEC4.4.1.1),又称为胱硫醚酶(cystathionase),是转硫化(transsulfuration)通路中的关键酶之一。在细菌、真菌和植物中,为正向(forward)转硫化,而在哺乳动物、真菌和某些细菌为逆向(reverse)转硫化,构成含硫氨基酸半cysteine)和蛋氨酸(methionine)的相互转换,调节高半浓度和半合成,并参与合成。胱硫醚-γ-裂解酶为辅基5-磷酸吡哆醛(pyridoxal-5-phosphatePLP)依赖性酶,催化胱硫醚(cystathionine)降解为半2-丁酮酸甲酯(α-ketobutyrate)和氨并具有催化高(homoserine)消去反应(elimination reaction),产生2-丁酮酸甲酯(α-ketobutyrate)、氨和水;催化(cystine)消去反应,产生硫化半thiocysteine)丙酮酸和氨;催化半的消去反应,产生丙酮酸、硫化氢和氨。胱硫醚-γ-裂解酶参与硫化氢代谢通路(第三种气体性传导介质gasotransmitter)调节,与血管松弛、炎性反应、凋亡、缺血再灌注、氧化应激等有关。人体胱硫醚-γ-裂解酶异常,会导致胱硫醚尿症(cystathioninuria)、病(cystinosis)、恶性淋巴细胞病变等疾病,对于酒精性肝损伤敏感。基于底物胱硫醚,胱硫醚-γ-裂解酶的催化下,产生2-丁酮酸甲酯(α-ketobutyrate)和氨,进而半侧链巯基与Ellman试剂5,5-二硫基-双(2-硝基苯甲酸)[5,5’-dithiobis-2-nitrobenzoic acid);DTNB]反应后,产生黄色的5-巯基-2-硝基苯甲酸(5-thio-2-nitrobenzoic acidTNB,通过其吸收峰值的变化412nm波长,来定量分析胱硫醚-γ-裂解酶的活性。胱硫醚-γ-裂解酶反应系统为:

 

产品内容

 

清理液(Reagent A        毫升

裂解液(Reagent B        毫升

缓冲液(Reagent C        毫升

反应液(Reagent D        

底物液(Reagent E        

阴性液(Reagent F          微升

显色液(Reagent G         微升

产品说明书              1

 

保存方式

 

保存裂解液(Reagent B)、反应液(Reagent D底物液(Reagent E和显色液(Reagent G在-20冰箱里其余的保存在4冰箱里;显色液(Reagent G避免光照;有效保证6

 

用户自备

 

1.5毫升离心管:用于样品保存的容器

15毫升锥形离心管:用于样品制备的容器

细胞刮脱棒:用于脱离贴壁细胞

(微型)台式离心机:用于样品制备

200微升1厘米光径比色皿或96孔板:用于光度分析的容器

分光光度仪或酶标仪:用于光度分析

 

实验步骤

 

一、 样品准备

 

1. 准备好25cm2细胞培养瓶或60mm细胞培养皿的待测培养细胞(15 X 106细胞)

2. 小心加入xx毫升清理液(Reagent A,覆盖生长表面

3. 小心抽去清理液

4. 使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞(注意:可以使用消化

5. 加入xx毫升清理液(Reagent A,混匀细胞

6. 移入到预冷的15毫升锥形离心管(注意:悬浮细胞从这一步骤开始

7. 放进4℃台式离心机离心5分钟,速度为300g

8. 小心抽去上清液

9. 加入xx微升裂解液(Reagent B,充分混匀

10. 转移到预冷的1.5毫升离心管

11. 强力涡旋震荡15

12. 置于冰槽里孵育30分钟

13. 放进4℃微型台式离心机离心10分钟,速度为16000g(或13000RPM,例如eppendorf 5415

14. 小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管 

15. 移取10微升进行蛋白定量检测(注意:建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒-30030.1

16. 即刻放进-70℃保存或置于冰槽里继续后续操作

 

二、 测定准备

 

1. 开启并设定好分光光度仪(温度为37℃):波长412nm,并置零

2. 从-20℃冰箱里取出试剂置于冰槽里融化;反应液(Reagent D底物液(Reagent E显色液(Reagent G避免光照

3. 缓冲液(Reagent C室温下均衡温度

 

三、 样品背景对照测定

 

1. 移取xx微升缓冲液(Reagent C到新的比色皿

2. 加入xx微升底物液(Reagent E

3. 加入xx微升阴性液(Reagent F

4. 加入20微升待测样品(100微克蛋白)(注意:样品须清澈

5. 上下倾倒数次,混匀

6. 37℃温度下孵育30分钟

7. 加入xx微升显色液(Reagent G,混匀

8. 37℃温度下孵育5分钟

9. 即刻放进分光光度仪检测,此为样品背景对照 

 

四、 样品活性测定

 

1. 移取xx微升缓冲液(Reagent C到新的比色皿

2. 加入xx微升反应液(Reagent D

3. 加入xx微升底物液(Reagent E

4. 加入20微升待测样品(100微克蛋白)(注意:样品须清澈

5. 上下倾倒数次,混匀

6. 37℃温度下孵育30分钟

7. 加入xx微升显色液(Reagent G,混匀

8. 37℃温度下孵育5分钟

9. 即刻放进分光光度仪检测,此为样品读数 

 

五、计算样品活性

 

 

六、 酶标仪测定

 

1. 96孔板上做好相应标记:样品背景对照和样品活性

2. 分别移取xx微升缓冲液(Reagent C96孔板的所有孔里

3. 加入xx微升阴性液(Reagent E到样品背景对照孔里

4. 加入xx微升反应液(Reagent D到样品活性孔里

5. 分别加入xx微升底物液(Reagent E到所有孔里

6. 分别加入20待测样品(100微克蛋白)到所有(注意:样品须清澈

7. 轻轻摇动96孔板

8. 37℃温度下孵育30分钟

9. 分别加入xx微升显色液(Reagent G所有

10. 轻轻摇动96孔板

11. 37℃温度下孵育5分钟

12. 即刻放进酶标仪检测:获得背景和样品活性读数

13. 活性计算:

 

 

 

注意事项

 

1. 本产品为20次操作,包括背景对照

2. 操作时,须戴手套

3. 系统操作过程中,背景测定只需1

4. 样品须澄清,至关重要

5. 测定值由变化

6. 光度测定后,比色皿须清洗

7. 反应时间持续30分钟

8. 建议待测样本蛋白浓度为100微克/20微升(本公司提供  Bradford蛋白质浓度定量试剂盒-30030.1

9. 如果待测样品浓度过高或过低,可以调整样品浓度

10. 可以使用胱硫醚-γ-裂解酶抑制剂DL-炔丙基DL-Propargylglycine)作为抑制剂对照或阴性对照

11. 胱硫醚-γ-裂解酶单位活性定义为:在37pH 8.2条件下,每分钟内产生1微摩尔所需的酶量作为一个活性单位

12. 本公司提供系列转硫化transsulfuration)通路分析试剂产品

 

质量标准

 

1. 本产品经鉴定性能稳定

2. 本产品经鉴定检测敏感

 

 


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