细胞胱硫醚-γ-裂解酶活性光度法定量检测试剂盒产品说明书

主要用途

细胞胱硫醚-γ-裂解酶（cystathionine γ-lyase；CGL）活性光度法定量检测试剂是一种旨在运用胱硫醚作为底物，在裂解酶的催化下，产生半，使用Ellman试剂后，呈现黄色5-巯基-2-硝基苯甲酸产物吸光峰值的变化，即采用光度法来测定细胞裂解样品中酶活性的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种细胞裂解悬液或纯化酶样品胱硫醚-γ-裂解的活性检测，以及抑制剂筛选。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。

技术背景

胱硫醚-γ-裂解酶（cystathionine γ-lyase；CGL；EC4.4.1.1），又称为胱硫醚酶（cystathionase），是转硫化（transsulfuration）通路中的关键酶之一。在细菌、真菌和植物中，为正向（forward）转硫化，而在哺乳动物、真菌和某些细菌为逆向（reverse）转硫化，构成含硫氨基酸半（cysteine）和蛋氨酸（methionine）的相互转换，调节高半浓度和半合成，并参与合成。胱硫醚-γ-裂解酶为辅基5-磷酸吡哆醛（pyridoxal-5-phosphate；PLP）依赖性酶，催化胱硫醚（cystathionine）降解为半、2-丁酮酸甲酯（α-ketobutyrate）和氨；并具有催化高（homoserine）消去反应（elimination reaction），产生2-丁酮酸甲酯（α-ketobutyrate）、氨和水；催化（cystine）消去反应，产生硫化半（thiocysteine）丙酮酸和氨；催化半的消去反应，产生丙酮酸、硫化氢和氨。胱硫醚-γ-裂解酶参与硫化氢代谢通路（第三种气体性传导介质gasotransmitter）调节，与血管松弛、炎性反应、凋亡、缺血再灌注、氧化应激等有关。人体胱硫醚-γ-裂解酶异常，会导致胱硫醚尿症（cystathioninuria）、病（cystinosis）、恶性淋巴细胞病变等疾病，对于酒精性肝损伤敏感。基于底物胱硫醚，在胱硫醚-γ-裂解酶的催化下，产生半、2-丁酮酸甲酯（α-ketobutyrate）和氨，进而半侧链巯基与Ellman试剂5,5-二硫基-双（2-硝基苯甲酸）[5,5’-dithiobis-（2-nitrobenzoic acid）；DTNB]反应后，产生黄色的5-巯基-2-硝基苯甲酸（5-thio-2-nitrobenzoic acid；TNB），通过其吸收峰值的变化（412nm波长），来定量分析胱硫醚-γ-裂解酶的活性。胱硫醚-γ-裂解酶反应系统为：

产品内容

清理液（Reagent A）        毫升

裂解液（Reagent B）        毫升

缓冲液（Reagent C）        毫升

反应液（Reagent D）        微升

底物液（Reagent E）        毫升

阴性液（Reagent F）          微升

显色液（Reagent G）         微升

产品说明书              1份

保存方式

保存裂解液（Reagent B）、反应液（Reagent D）、底物液（Reagent E）和显色液（Reagent G）在－20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里；显色液（Reagent G）避免光照；有效保证6月

用户自备

1.5毫升离心管：用于样品保存的容器

15毫升锥形离心管：用于样品制备的容器

细胞刮脱棒：用于脱离贴壁细胞

（微型）台式离心机：用于样品制备

200微升1厘米光径比色皿或96孔板：用于光度分析的容器

分光光度仪或酶标仪：用于光度分析

实验步骤

一、 样品准备

1． 准备好25cm²细胞培养瓶或60mm细胞培养皿的待测培养细胞（1至5 X 10⁶细胞）

2． 小心加入xx毫升清理液（Reagent A），覆盖生长表面

3． 小心抽去清理液

4． 使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞（注意：可以使用消化）

5． 加入xx毫升清理液（Reagent A），混匀细胞

6． 移入到预冷的15毫升锥形离心管（注意：悬浮细胞从这一步骤开始）

7． 放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为300g

8． 小心抽去上清液

9． 加入xx微升裂解液（Reagent B），充分混匀

10． 转移到预冷的1.5毫升离心管

11． 强力涡旋震荡15秒

12． 置于冰槽里孵育30分钟

13． 放进4℃微型台式离心机离心10分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）

14． 小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管 

15． 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－30030.1）

16． 即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作

二、 测定准备

1． 开启并设定好分光光度仪（温度为37℃）：波长412nm，并置零

2． 从－20℃冰箱里取出试剂，置于冰槽里融化；反应液（Reagent D）、底物液（Reagent E）和显色液（Reagent G）避免光照

3． 缓冲液（Reagent C）室温下均衡温度

三、 样品背景对照测定

1． 移取xx微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入xx微升底物液（Reagent E）

3． 加入xx微升阴性液（Reagent F）

4． 加入20微升待测样品（100微克蛋白）（注意：样品须清澈）

5． 上下倾倒数次，混匀

6． 在37℃温度下孵育30分钟

7． 加入xx微升显色液（Reagent G），混匀

8． 在37℃温度下孵育5分钟

9． 即刻放进分光光度仪检测，此为样品背景对照 

四、 样品活性测定

1． 移取xx微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入xx微升反应液（Reagent D）

3． 加入xx微升底物液（Reagent E）

4． 加入20微升待测样品（100微克蛋白）（注意：样品须清澈）

5． 上下倾倒数次，混匀

6． 在37℃温度下孵育30分钟

7． 加入xx微升显色液（Reagent G），混匀

8． 在37℃温度下孵育5分钟

9． 即刻放进分光光度仪检测，此为样品读数 

五、计算样品活性

六、 酶标仪测定

1． 在96孔板上做好相应标记：样品背景对照和样品活性

2． 分别移取xx微升缓冲液（Reagent C）到96孔板的所有孔里

3． 加入xx微升阴性液（Reagent E）到样品背景对照孔里

4． 加入xx微升反应液（Reagent D）到样品活性孔里

5． 分别加入xx微升底物液（Reagent E）到所有孔里

6． 分别加入20微升待测样品（100微克蛋白）到所有孔里（注意：样品须清澈）

7． 轻轻摇动96孔板

8． 在37℃温度下孵育30分钟

9． 分别加入xx微升显色液（Reagent G）到所有孔里

10． 轻轻摇动96孔板

11． 在37℃温度下孵育5分钟

12． 即刻放进酶标仪检测：获得背景和样品活性读数

13． 活性计算：

注意事项

1． 本产品为20次操作，包括背景对照

2． 操作时，须戴手套

3． 系统操作过程中，背景测定只需1次

4． 样品须澄清，至关重要

5． 测定值由低到高变化

6． 光度测定后，比色皿须清洗

7． 反应时间持续30分钟

8． 建议待测样本蛋白浓度为100微克/20微升（本公司提供  Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－30030.1）

9． 如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度

10． 可以使用胱硫醚-γ-裂解酶抑制剂DL-炔丙基（DL-Propargylglycine）作为抑制剂对照或阴性对照

11． 胱硫醚-γ-裂解酶单位活性定义为：在37℃，pH 8.2条件下，每分钟内产生1微摩尔半所需的酶量作为一个活性单位

12． 本公司提供系列转硫化（transsulfuration）通路分析试剂产品

质量标准

1． 本产品经鉴定性能稳定

2． 本产品经鉴定检测敏感