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通用型细菌鉴定16S rDNA PCR扩增检测试剂盒
点击次数:1066 更新时间:2017-01-18

通用型细菌鉴定16S rDNA PCR扩增检测试剂盒

产品说明书
主要用途
通用型细菌鉴定16S rDNA PCR扩增检测试剂是一种旨在根据保守性序列设计引物,针对微生物样本DNA进行PCR扩增,进一步测序后借助分析工具予以同源比较,由可变序列识别和分类微生物样品的而经典的技术方法。该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的。可以被用于各种微生物的鉴定、归类、建树等系统微生物学的研究。产品即到即用,性能稳定,操作简便,扩增效率显著。
技术背景
16SrRNA作为非培养依赖性标记的分子指模(fingerprinting)技术,有别于传统的选择性培养技术,用于研究微生物的分类学(phylogenetics)。核糖体RNA(ribosome RNA)存在于所有微生物体内,且结构与功能进化保留;容易分离和识别;其一级和二级结构具有高度进化保守区域(conserved region)和物种特异性可变区域(variable region);其基因序列变异非常缓慢,且不会发生平行基因转移(horizontal gene transfer)。其包括5S、16S、23S。5S信息量不够充分;23S不稳定;而微生物16SrRNA基因较为稳定,初级结构含有1500个碱基。通过引物设计,扩增产物测序,数据库对照,鉴定微生物的类别或建立新的微生物在进化树上的位置。
产品内容
扩增液(Reagent A) 微升
引物液(Reagent B) 微升
补充液(Reagent C) 毫升
测序引物A(Reagent D) 微升
测序引物B(Reagent E) 微升
产品说明书 1份
保存方式
保存在-20℃冰箱里;有效保证6月
用户自备
PCR级矿物油:用于封隔反应液
PCR仪:用于样品扩增
PCR管或平板:用于PCR反应的容器
琼脂糖凝胶电泳:用于扩增后电泳分析
实验步骤
实验开始前,从-20℃冰箱中取出试剂,放进冰槽里融化。然后进行下列操作: 
1. 针对一个样本,每次移出 15 微升 扩增液(Reagent A)到 PCR 管
2. 加入 1 微升用户自备的的待测 DNA 样品(总量 100 纳克)
3. 微升 引物液(Reagent B)
4. 再加入 微升 补充液(Reagent C)(反应总量为 25 微升)
5. 即刻放进微型台式离心机瞬时离心 5秒,速度为500g(或2000RPM;例如 eppendorf 5415)
6. (选择步骤)加入 50微升用户自备的 PCR 级矿物油(注意:参见注意事项 13)
7. 即刻进行热启动 PCR 反应:
温度(℃)时间  循环
95       2分钟   1
95       1分钟   30
45       1分钟   30
70       1分钟   30
70       5分钟    1
8. 反应完毕后,移取5微升进行1.0%琼脂糖凝胶电泳:产物为1.5kb左右
9. 如果继续测序鉴定,胶回收PCR产物(建议使用)
10.分别移出2微升用户自备的测序反应液到2个不同的新的1.5毫升离心管
11.加入1微升测序引物A(Reagent D)到其中一个1.5毫升离心管,作好标记
12.加入1微升测序引物B(Reagent E)到另一个1.5毫升离心管,作好标记
13.进行后续的测序反应
注意事项
1. 本产品为20次操作
2. 操作时,须戴手套
3. 建议使用带滤芯的枪头,避免污染
4. 在-20℃冰箱里储存的产品避免反复冻融
5. 建议样品为纯培养微生物的DNA;DNA提取应确保高纯度
6. 可以使用菌落直接检测:用无菌枪头点触
7. 如果没有扩增条带,可以直接测序,或询问特殊引物设计服务
8. 可以直接使用纯化的基因组DNA进行测序
9. 可以将扩增产物纯化后,克隆到质粒中,然后进行测序
10.测序引物A(Reagent D)为上游引物,可以获得500至1500的序列;引物序列为:
5-CAGCAGCCGCGGTAATAC3
11.测序引物B(Reagent E)为下游引物,可以获得0至500的序列;引物序列为:
5-GTATTACCGCGGCTGCTG-3
12.测序建议优先使用测序引物B(Reagent E),其可变区域较为特征
13.根据用户PCR仪的性能,决定是否加入矿物油(Mineral Oil)
14.建议使用软件测算Tm温度;参考公式为Tm=4(G+C)+2(A+T)
15.本公司提供16SrDNA特异性引物设计服务
16.测序后,序列分析和微生物分类分析工具参考如下:
1)样品序列与数据库已知微生物序列的比对(BLAST) 2
高质纯化胶回收试剂盒
http://www.ncbi.nlm.nih.gov
2)样品序列的分类学分析前的预编辑
http://iubio.bio.indiana.edu/soft/molbio/docs/biosoft-free.html
3)样品的进化树的确立
http://evolution.genetics.washington.edu/phylip.html
http://www.lms.si.edu/PAUP
4)16SrRNA 数据库
http://www.mikro.biologie.tu-muenchen.de
17.本公司提供系列细菌 16S rDNA 扩增检测试剂产品
质量标准
1. 本产品经鉴定性能稳定
2. 本产品经鉴定无核酶污染
3. 本产品经鉴定检测准确

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