细菌铁型亚硝酸盐还原酶活性比色法定量检测试剂盒

产品说明书

主要用途

细菌铁型亚硝酸盐还原酶活性比色法定量检测试剂是一种旨在通过底物亚硝酸盐，在铜型抑制剂的存在下，被催化产生氨或一氧化氮的同时，人工电子供体还原型甲基紫精氧化后呈现吸光峰值的变化，即采用比色法来测定样品中铁型亚硝酸盐还原酶特异活性的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种细菌细胞裂解悬液样品的铁型亚硝酸盐还原酶的特异活性检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，重复性好。

技术背景

亚硝酸盐还原酶（nitrite reductase；NiR）是一类催化亚硝酸盐为氨或一氧化氮的还原反应的酶，其分成同化型（assimilatory）和异化型（dissimilatory）亚硝酸还原酶，在生物氮循环进行厌氧能量代谢中起着重要作用。同化型酶以铁氧还原蛋白、FAD、非血红素铁、西罗血红素（siroheme）、NAD（P）H等为电子供体，进行6个电子的还原产生氨（ammonification），包括高等植物、绿藻及蓝藻、粗糙脉孢菌（Neur-ospora crassa）、和大肠埃希氏菌（Escherichia coli）等。异化型酶参与使用亚硝酸氧化有机物质的过程，包括单电子反应生成NO和6个电子的还原产生氨。其脱氮作用（denitrification）是细菌或真菌等获得能量、适应环境生存的生理过程。脱氮细菌、真菌或植物的亚硝酸还原酶有二种：铜型和铁型。铜型（CuNiR）含有类似于铜蓝蛋白（azurin）的铜中心部位，铜蓝蛋白为电子供体；铁型（ccNiR）含有同源双体，分别62Kd，包括c型和d1型细胞色素结构域，细胞色素C为电子供体。铜型和铁型的生理反应相同，但同一细菌互不共有（mutual exclusive）。铁型（EC1.9.3.2），又称为细胞色素C型（cytochrome C）或亚铁血红素型（heme），由基因nrfA编码，主要在假单胞杆菌（pseudomonas）、某种产碱杆菌（alcaligenes）、球状菌（micrococcus）等细菌周质（periplasmic）中存在。基于底物亚硝酸盐（KNO2），在铜型抑制剂二乙基二硫代氨基甲酸烯丙基（diethyldithiocarbamate；DDC）和人工电子供体还原型甲基紫精（methyl viologen）的参与下，受到亚硝酸盐还原酶的催化产生氨或一氧化氮，同时还原型甲基紫精转化为氧化型甲基紫精，通过其吸收峰值的变化（600nm波长），来定量分析铁型亚硝酸盐还原酶的特异活性。其反应方式为： 

产品内容

保存方式

保存在－20℃冰箱里，有效保证6月

用户自备

1.5毫升离心管：用于制备样品的容器

（微型）台式离心机：用于样品处理

恒温水槽：用于反应孵育

酶标板或比色皿：用于比色的容器

酶标仪或分光光度仪：用于样品比色分析

实验步骤

一、样品准备

• 准备好500微升待测细菌（OD600＝0.4至0.8，即1至2 X 10⁷细胞/毫升）
• 转移到到1.5毫升离心管
• 放进4℃微型台式离心机离心5分钟，速度为1000g（或3500RPM，例如EPPENDORF 5415）
• 小心抽去上清液
• 加入xx微升裂解液（Reagent A），充分混匀
• 加入xx微升活性液（Reagent B）
• 强力涡旋震荡15秒
• 置于冰槽里15分钟
• 放进4℃微型台式离心机离心15分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管
• 移取10微升进行蛋白定量检测
• 即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作

• 测读准备

• 准备好待测样品，置于冰槽里融化 
• 设定好分光光度仪：温度37℃，波长600nm，间隔1分钟，测读6次（共5分钟），并置零或设置0分钟和5分钟各测读1次
• 测定开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的还原液（Reagent F）和稀释液（Reagent G）置于冰槽里融化，然后移出xx微升稀释液（Reagent G）到1管还原液（Reagent F），混匀后，置于冰槽里备用；用毕即刻放进－70℃保存
• 测定开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的反应液（Reagent E）置入冰槽里融化，然后移出40微升到新的1.5毫升离心管，加入xx微升上述新鲜配制的还原液（Reagent F），轻柔混匀后，置于冰槽里，标记为反应工作液，放在暗室里备用
• 缓冲液（Reagent C）室温下均衡温度

• 背景对照测定

• 移取xx微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入xx微升底物液（Reagent D）
• 加入xx微升含有反应液（Reagent E）和还原液（Reagent F）的反应工作液
• 加入xx微升阴性液（Reagent H）
• 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
• 即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照（0分钟读数－5分钟读数）：

• 样品测定

• 移取xx微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入xx微升底物液（Reagent D）
• 加入xx微升含有反应液（Reagent E）和还原液（Reagent F）的反应工作液
• 加入10微升待测样品（注意：建议总量50微克细菌总蛋白，且样品需澄清）
• 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
• 即刻放进分光光度仪检测，此为样品读数（0分钟读数－5分钟读数）：

• 计算样品活性

• 酶标板测定

• 在96孔酶标板上做好相应标记：背景空对照和待测样品
• 分别移取xx微升缓冲液（Reagent C）到所有孔里
• 分别加入xx微升底物液（Reagent D）到所有孔里
• 分别加入xx微升含有反应液（Reagent E）和还原液（Reagent F）的反应工作液
• 分别加入xx微升阴性液（Reagent H）或待测样品（注意：建议总量50微克细菌总蛋白，且样品需澄清）到相应孔里
• 轻轻摇动96孔酶标板
• 即刻放进酶标仪检测：获得吸光读数（0分钟读数和5分钟读数）
• 计算样品酶活性

注意事项

• 本产品为20次操作，包括背景对照
• 操作时，须戴手套
• 如果需要诱导亚硝酸盐还原酶的活性，*加入FAD或FAM；第二，密封培养瓶瓶盖，充入氩气（argon）培养过夜，确保厌氧状态；第三，必要时加入氯化铁或氯化钙
• 样品中避免含有各种还原性化学物质，包括巯基乙醇（2-mercaptoethanol）、二硫苏糖醇（dithiothreitol；DTT）、维生素C（ascorbic acid）和*（azide）等
• 系统操作过程中，背景测定只需1次
• 加样后3秒内进行比色测定
• 样本测定5分钟读数低于0分钟读数表明具有酶活性
• 比色测定后，比色皿须清洗*
• 如果待测样品浓度过高或过低，可以增加或减少甚至稀释样品量
• 建议待测样本总蛋白浓度为50微克/10微升；如果样本酶活性过低或过高，则可以增加或降低样本量
• 铁型亚硝酸盐还原酶单位活性定义为：在37℃，pH 7.5条件下，每分钟内能够还原1微摩尔亚硝酸盐所需的酶量作为一个活性单位
• 本公司提供系列亚硝酸盐还原酶分析试剂产品

质量标准

• 本产品经鉴定性能稳定
• 本产品经鉴定检测敏感