细胞内核酸氧化8-羟基脱氧鸟苷（8-OHdG）比色法测定试剂盒

产品说明书

主要用途
细胞内核酸氧化8-羟基脱氧鸟苷（8-OHdG）比色法测定试剂是一种旨在使用单克隆抗8-羟基脱氧鸟苷抗
体以及辣根过氧化物酶缀合物二抗，通过染料四甲基联苯胺染色显示蓝色，即通过比色法定量评价DNA
损伤水平的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。主要适用于各种活体细胞（动
物、人体等）的8-羟基脱氧鸟苷的定量分析。广泛用于细胞衰老、细胞凋亡、肿瘤等的研究。产品严格无
菌，即到即用，反应敏感，操作简捷，性能稳定，显色清晰。
技术背景
核酸氧化损伤（nucleotide oxidative damage），包括DNA 和RNA 损伤，是由于环境因子或细胞代谢影响，
在逃避细胞防御机制的前提下，所产生的四种损伤之一：氧化、烷化（alkylation）、水解和碱基错配损伤等。
而氧化损伤主要通过活性氧族（reactive oxygen species；ROS），包括超氧自由基阴离子（superoxide radical；
O2-）、过氧化氢（hydrogen peroxide；H2O2）、羟自由基或氢氧基（hydroxyl radical；OH-）、过氧化基（peroxyl
radical；ROO-）、氢过氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；
NO-）、过氧亚硝基阴离子（peroxynitrite anion；ONOO-）等的作用，使碱基羟基化和嘌呤环裂开，诱导鸟
嘌呤（guanine；G）向胸腺嘧啶（thymine；T）的颠换（transversion），造成体细胞基因突变，影响细胞周
期、基因转录、细胞凋亡等，zui终导致各种疾病的发生，例如糖尿病、高血压、中风、癌症、衰老等。其
中核酸损伤产物8-羟基脱氧鸟苷（8-hydroxy-2’-deoxyguanosine；8-OHdG）作为DNA 损伤的分子标志；8-
羟基鸟苷（8-hydroxyguanosine）作为RNA 损伤的分子标志。8-羟基脱氧鸟苷是zui常见的DNA 损伤产物，
也是氧化应急的生物标志。四甲基联苯胺（3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine，TMB）是过氧化物酶（Peroxidase）
的生色底物，在过氧化物酶的催化下，电子供体TMB 底物在过氧化氢氧化下失去电子，产生游离自由阳
离子单电子氧化产物，在pH4.9 条件下，呈现出颜色变化和沉积，形成蓝色沉淀产物，且不受乙醇影响。
被用于检测标记过氧化物酶的活性，灵敏度高，特异性好。
产品内容
清理液（Reagent A） 毫升
固着液（Reagent B） 毫升
酶解液A（Reagent C） 毫升
酶解液B（Reagent D） 毫升
变性液（Reagent E） 毫升
中和液（Reagent F） 毫升
封阻液A（Reagent G） 毫升
封阻液B（Reagent H） 毫升
抗体液（Reagent I） 毫升
二抗液（Reagent J） 毫升
染色液（Reagent K） 毫升
产品说明书1 份
保存方式
2
保存在－20℃冰箱里，严禁反复冻融；染色液（Reagent K）避免光照；有效保证6 月
用户自备
96 孔细胞培养板：用于细胞培养的容器
培养箱：用于细胞染色孵育
酶标仪：用于比色分析
实验步骤
实验开始前，将－20℃冰箱里试剂盒中的试剂置入冰槽里融化。然后进行下列操作：
1． 准备1 个96 孔细胞培养板
2． 接种待测细胞（2 X 104 细胞）
3． 小心抽去细胞培养液
4． 加入xx 微升清理液（Reagent A），铺满培养表面
5． 小心抽去清理液（Reagent A）
6． 加入xx 微升－20℃预冷的固着液（Reagent B）
7． 置于－20℃冰箱里孵育20 分钟
8． 小心抽去固着液（Reagent B）
9． 空气中晾干
10．加入xx 微升清理液（Reagent A）
11．室温下孵育2 分钟
12．小心抽去清理液（Reagent A）
13．加入xx 微升酶解液A（Reagent C）
14．置于37℃培养箱里孵育60 分钟
15．小心抽去酶解液A（Reagent C）
16．加入xx 微升清理液（Reagent A）
17．室温下孵育2 分钟
18．小心抽去清理液（Reagent A）
19．重复实验步骤16 至18 一次
20．加入xx 微升酶解液B（Reagent D）
21．置于37℃培养箱里孵育10 分钟
22．小心抽去酶解液B（Reagent D）
23．加入xx 微升清理液（Reagent A）
24．室温下孵育2 分钟
25．小心抽去清理液（Reagent A）
26．重复实验步骤23 至25 一次
27．加入xx 微升变性液（Reagent E）
28．室温下孵育10 分钟
29．小心抽去变性液（Reagent E）
30．加入xx 微升中和液（Reagent F）
31．室温下孵育5 分钟
32．小心抽去中和液（Reagent F）
3
33．加入xx 微升清理液（Reagent A）
34．室温下孵育2 分钟
35．小心抽去清理液（Reagent A）
36．重复实验步骤33 至35 一次
37．加入xx 微升封阻液A（Reagent G）
38．室温下孵育30 分钟
39．小心抽去封阻液A（Reagent G）
40．加入xx 微升清理液（Reagent A）
41．室温下孵育2 分钟
42．小心抽去清理液（Reagent A）
43．重复实验步骤40 至42 一次
44．加入xx 微升封阻液B（Reagent H）
45．室温下孵育30 分钟
46．小心抽去封阻液B（Reagent H）
47．加入xx 微升抗体液（Reagent I）
48．置于37℃培养箱里孵育60 分钟（或4 冰箱里孵育过夜）
49．小心抽去抗体液（Reagent I）
50．加入xx 微升清理液（Reagent A）
51．置于37℃培养箱里孵育2 分钟
52．小心抽去清理液（Reagent A）
53．重复实验步50 至52 二次
54．加入xx 微升二抗液（Reagent J）
55．置于37℃培养箱里孵育60 分钟，避免光照
56．小心抽去二抗液（Reagent J）
57．加入xx 微升清理液（Reagent A）
58．置于37℃培养箱里孵育2 分钟
59．小心抽去清理液（Reagent A）
60．重复实验步57 至59 二次
61．小心加入xx 微升的染色液（Reagent K）
62．室温下孵育30 分钟，避免光照（注意：可见蓝色沉淀）
63．即刻放进酶标仪测读：波长650nm
64．构建细胞-DNA 损伤曲线：纵座标（Y 轴）吸光值（OD）为DNA 损伤程度；横坐标（X 轴）为细胞
数、时间点或药物处理浓度等
注意事项
1． 本产品为20 次操作量
2． 操作时，须戴手套
3． 细胞培养操作时，须严格无菌，以防污染
4． 孵育时，须避免光照
5． 染色时间可以根据情况调整，以免造成过度染色或背景过深
6． 如果染色过快或过深，建议稀释一抗和二抗浓度
7． 如果用户没有650nm 的滤波器，可以使用630 至650 之间的任一波长
8． 建议细胞染色完成后，即刻进行比色分析
4
9． 本公司提供系列DNA 损伤检测试剂产品
质量标准
1． 本产品经鉴定性能稳定
2． 本产品经鉴定检测敏感