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胞浆内钙离子浓度荧光检测试剂盒
点击次数:796 发布时间:2017-01-18

胞浆内钙离子浓度荧光检测试剂盒

产品说明书

 

主要用途

 

胞浆内钙离子浓度荧光检测试剂是一种旨在通过线粒体钙离子特异性荧光探针Fura-2-AM与钙离子结合后,其荧光强度显著增强,在荧光分光光度仪下测量不同激发波长下相对荧光峰值的比值来测定细胞浆总钙离子浓度而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的其适用于各种活体细胞(动物、人体等)或冰冻切片组织细胞浆钙离子的浓度检测。产品严格无菌,即到即用,操作简捷,性能稳定,检测敏感。

 

技术背景

 

钙是人体中的一种重要电介质和矿物质,占1150克。其中99%的钙以氟磷灰石(calcium fluorophosphate apatite)形式存在于骨组织中。非骨组织钙成分主要存在于细胞内。钙具有两种主要形式:一种是非弥散型蛋白结合钙,其构成约40%至50%的血清中的总钙含量;另一种为弥散型游离钙,其进一步分成具有活性的复合钙(complexed calcium)和离子钙(ionized calcium)。钙对神经肌肉兴奋性neuromuscular excitability)、血液凝固酶的激活、离子跨膜运输、释放神经传导介质、信使传导等方面起着重要作用。在细胞内,钙离子主要储存在线粒体和内质网等细胞器中。其中细胞浆钙离子在调节钙离子通道,维持细胞内环境钙离子平衡方面起着重要作用。细胞浆钙的检测包括沉淀法、EDTA鳌合滴定法、火焰光度法flame photometry)、原子吸收分光光度法等技术,但容易受到钠、钾、磷酸盐、硫酸盐的干扰,或者受限于仪器的特殊的要求,以及需要线粒体、细胞浆分离。Fura-2 AM(acetoxy-methyl ester),一种具有细胞膜通透性,与钙离子结合产生荧光的染料,通过其不同激发波长340nm/380nm产生的荧光信号比(散发波长510nm)来测定细胞浆内钙离子水平。 

 

产品内容

 

清理液(Reagent A)      毫升

染色液(Reagent B)  微升

介导液(Reagent C)      微升

饱和液(Reagent D)      毫升

阴性液(Reagent E)      毫升

裂解液(Reagent F)      微升

产品说明书  1份

 

保存方式

 

保存染色液(Reagent B)和介导液(Reagent C)在-20冰箱里,避免光照;其余的保存4冰箱里有效保证6

 

用户自备

 

1.5毫升离心管:用于工作液配制的容器

细胞培养箱:用于染色孵育

96孔培养板:用于样品操作的容器

荧光酶标仪:用于荧光分析

(共聚焦)荧光显微镜:用于荧光染色观察

 

实验步骤

 

  • 测定准备

 

  • 设定好荧光酶标仪:激发波长340nm和380nm,散发波长510nm
  • 测定开始前,将-20℃冰箱里的试剂盒中的染色液(Reagent B室温下融化,然后分别移出  微升介导液(Reagent C  微升染色液(Reagent B到新的1.5毫升离心管,标记为染色工作液,并放在暗室里备用。然后进行下列操作。 

 

二、荧光酶标仪检测

 

  • 准备196细胞培养板,标记为:细胞样品孔、空白对照孔(不含细胞)、zui大对照孔(含细胞)
  • 小心抽去细胞样品孔的培养液
  • 加入  微升清理液(Reagent A)到细胞样品孔里
  • 加入  微升饱和液(Reagent D到zui大对照孔里
  • 加入  微升阴性液(Reagent E到空白对照孔
  • 分别加入  微升染色工作到所有孔里
  • 轻轻摇动酶标板,混匀
  • 放进37细胞培养箱里孵育60分钟,避免光照
  • 小心抽去细胞样品孔里的上清液
  • 小心加入  微升清理液(Reagent A)细胞样品孔
  • 重复实验步骤11和12一次
  • 放进37细胞培养箱里孵育30分钟
  • 加入  微升裂解液(Reagent F)zui大对照孔
  • 放进37细胞培养箱里孵育15分钟
  • 即刻放进荧光酶标仪测读:获得相对荧光单位(relative fluorescence unit;RFU)包括样品RFU340nm、样品RFU380nm空白对照孔RFU340nm空白对照孔RFU380nmzui大对照孔RFU340nm、zui大对照孔RFU380nm
  • 计算样品细胞浆钙离子浓度 

 

 

 

三、(共聚焦)或荧光显微镜检测

 

1. 准备1个待测的细胞爬片样品

  • 小心加上  微升清理液(Reagent A)覆盖样品表面
  • 小心移去样品上的清理液(Reagent A)
  • 移取  微升清理液(Reagent A)到新的1.5毫升离心管
  • 加入  微升染色工作液,混匀 
  • 小心加上上述含有染色工作液的溶液到样品上,覆盖样品表面
  • 放进37细胞培养箱里孵育60分钟,避免光照
  • 小心移去样品上的染色工作液
  • 小心加上  微升新鲜的清理液(Reagent A)
  • 小心移去清理液(Reagent A)
  • 小心加上  微升新鲜的清理液(Reagent A)
  • 放进37℃细胞培养箱里孵育30分钟
  • 小心移去清理液(Reagent A)
  • 盖上盖玻片
  • 即刻在(共聚焦)荧光显微镜下进行观察:激发波长340至400nm,散发波长510nm(细胞浆钙离子呈现荧光

 

四、冰冻切片检测

 

  • 准备1个待测的冰冻切片
  • 小心加上  微升清理液(Reagent A)覆盖切片样品表面
  • 小心移去样品上的清理液(Reagent A)
  • 移取  微升清理液(Reagent A)到新的1.5毫升离心管
  • 加入  微升染色工作液,混匀 
  • 小心加上上述含有染色工作液的溶液切片样品上,覆盖样品表面
  • 放进37细胞培养箱里孵育60分钟,避免光照
  • 小心移去切片上的染色工作液
  • 小心加上  微升新鲜的清理液(Reagent A)
  • 小心移去清理液(Reagent A)
  • 小心加上  微升新鲜的清理液(Reagent A)
  • 放进37℃细胞培养箱里孵育30分钟
  • 小心移去清理液(Reagent A)
  • 盖上盖玻片
  • 即刻在(共聚焦)荧光显微镜下进行观察:激发波长340至400nm,散发波长510nm(组织细胞浆钙离子呈现荧光

 

注意事项

 

  • 本产品为20(显微镜)或60次(酶标板)操作
  • 操作时,须戴手套
  • 可以使用荧光分光光度仪检测
  • 如果细胞内酯酶缺失,则建议使用微注射(microinjection)技术
  • 避免使用EDTA等处理样品
  • 孵育反应完成后即刻进行荧光测定
  • 如果待测样品浓度过高或过低,可以调整样品浓度
  • 检测敏感度可达纳摩尔级钙浓度范围
  • 本公司提供系列钙生化检测试剂产品

 

质量标准

 

  • 本产品经鉴定性能稳定
  • 本产品经鉴定检测敏感
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