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纯化线粒体膜通道孔(MPTP)荧光检测试剂盒
点击次数:1057 更新时间:2017-01-18

纯化线粒体膜通道孔(MPTP)荧光检测试剂盒
产品说明书
主要用途
纯化线粒体膜通道孔(MPTP)荧光检测试剂是一种旨在通过钙黄绿素载入后离心处理或钴
淬灭技术,选择性地聚集在线粒体内呈现荧光染色,而存在于或由线粒体释放到线粒体外的
荧光染料,即刻发生荧光去除或淬灭,来分析和观察线粒体膜通道孔活性的而经典的技
术方法。该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的。其适用于各种纯化线粒体膜通
道孔活性(瞬时或开放状态)的检测。产品严格无菌,即到即用,活体检测,分辨率高,
操作简捷,性能稳定。
技术背景
线粒体膜通道孔(mitochondrial permeability transition pore;MPTP)是由线粒体内外膜成分
构成的非特异性且钙离子依赖性通道。在细胞凋亡或坏死时,线粒体内容物通过膜通道孔释
放到胞浆中。膜通道孔的开放,显著改变线粒体的通透性。钙离子过度进入、线粒体谷胱苷
肽的氧化和活性氧族水平的增加等导致膜通道孔的持续开放,而造成细胞色素C 的释放和
线粒体膜电位的消失。钙黄绿素-AM,又称双甲亚胺二乙酸钠荧光素-乙酰氧基甲基酯【bis
(bis-carboxymethyl amino methyl fluorescein)-acetoxymethyl ester】,作为荧光探针:第
一,适宜的分子量622kd,小于1.5kd;第二,几乎不具有膜结合性;第三,不是线粒体酶
的底物;第四,容易进入细胞及其线粒体。钙黄绿素-AM 进入线粒体后,被内酯酶切离,
产生具有极性的荧光性强的钙黄绿素,被线粒体俘获。同时线粒体外的钙黄绿素通过离心去
除或受到其淬灭剂钴离子的淬灭。一旦线粒体膜通道孔瞬时开放,钙黄绿素释放出线粒体外,
由于离心处理或被钴离子淬灭。线粒体内钙黄绿素荧光的变化,表明膜通道孔的开放状态。
产品内容
染色液(Reagent A) X 微升
中和液(Reagent B) X 毫升
保存液(Reagent C) X 毫升
说明书1 份
保存方式
保存染色液(Reagent A)在-20℃冰箱里,避免光照;其余的保存在4℃冰箱里;有效保证
6 个月
用户自备
96 孔酶标板:用于线粒体荧光分析的容器
1.5 毫升离心管:用于线粒体染色的容器
载波片/盖玻片:用于线粒体样品存放后荧光分析
微型台式离心机:用于沉淀线粒体
培养箱:用于染色孵育
(共聚焦)荧光显微镜:用于线粒体荧光分析
荧光分光光度仪或酶标仪:用于线粒体荧光定量分析
实验步骤
一、直接法
1. 准备好待测的纯化线粒体样品
2. 移取100 微升线粒体样品(总量为2 毫克)到1.5 毫升离心管
3. 加入X 微升染色液(Reagent A),混匀
4. 放进37℃细胞培养箱里孵育15 分钟,避免光照
5. 放进4℃微型台式离心机离心5 分钟,速度为16000g(或13000RPM,例如eppendorf
5415)
6. 小心抽去上清液
7. 加入X 微升37℃预热的保存液(Reagent C),混匀颗粒群
8. 放进4℃微型台式离心机离心5 分钟,速度为16000g(或13000RPM,例如eppendorf
5415)
9. 小心抽去保存液(Reagent C)
10.小心加入X 微升37℃预热的保存液(Reagent C),混匀颗粒群
11. 选择下列方式之一进行操作:
(A)使用(共聚焦)荧光显微镜观察(定性检测):
1)移取10 微升上述悬液到载波片上,盖上盖玻片
2)激发波长488nm,散发波长505nm――
绿色荧光减弱,表明膜通道孔活性(MPTP)增强
(B) 或使用荧光分光光度仪检测(定量检测):
1)移取100 微升上述悬液到100 微升比色杯或96 孔酶标板
2)即刻放进荧光分光光度仪:激发波长488nm,散发波长505nm――
RFU 降低,表明膜通道孔活性(MPTP)增强
二、间接法
实验开始前,将-20℃冰箱里的试剂盒中的染色液(Reagent A)置入冰槽里融化,中和液
(Reagent B)放进37℃恒温水槽里预热。然后移出10 微升染色液(Reagent A)到新的1.5
毫升离心管,加入100 微升中和液(Reagent B),混匀后,标记为染色工作液,置入暗室里。
然后进行下列操作。
1. 准备好待测的纯化线粒体样品
2. 移取100 微升线粒体样品(总量为2 毫克)到1.5 毫升离心管
3. 放进4℃微型台式离心机离心5 分钟,速度为16000g(或13000RPM,例如eppendorf
5415)
4. 小心抽去上清液
5. 加入X 微升含有染色液(Reagent A)和中和液(Reagent B)的染色工作液,充分混

6. 放进37℃细胞培养箱里孵育15 分钟,避免光照
7. 选择下列方式之一进行操作:
a) 使用(共聚焦)荧光显微镜观察(定性检测):
1)移取10 微升上述细胞悬液到载波片上,盖上盖玻片(每隔5 分钟检测一次,持续30 分
钟)
2)激发波长488nm,散发波长505nm――绿色荧光减弱,表明膜通道孔活性(MPTP)增

b) 或使用荧光分光光度仪检测(定量检测):
1) 移取100 微升上述悬液到100 微升比色杯或96 孔酶标板
2) 即刻放进荧光分光光度仪(每隔5 分钟检测一次,持续30 分钟):激发波长488nm,
散发波长505nm――RFU 降低,表明膜通道孔活性(MPTP)增强
注意事项
1. 本产品为20 次操作
2. 操作时,须戴手套
3. 染色前,所有试剂溶液,除染色液(Reagent A)外,需37℃预热
4. 建议染色完成后,即刻进行荧光检测分析
5. 孵育时,必须避免光照
6. 本产品友好使用于双重染色或重叠染色
7. 如果不具备505nm 散发波长的滤波器,可以使用505nm 至530nm 中的任一波长
8. 如果膜通道孔为瞬时开放(transient),则荧光缓慢且自发降低
9. 本公司提供膜通道孔抑制剂:0.2 毫摩尔环胞素A(cyclosporine A),维护荧光完整
10.本公司提供系列线粒体分析试剂产品
质量标准
1. 本产品经鉴定性能稳定
2. 本产品经鉴定荧光清晰

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