纯化线粒体膜通道孔（MPTP）荧光检测试剂盒
产品说明书
主要用途
纯化线粒体膜通道孔（MPTP）荧光检测试剂是一种旨在通过钙黄绿素载入后离心处理或钴
淬灭技术，选择性地聚集在线粒体内呈现荧光染色，而存在于或由线粒体释放到线粒体外的
荧光染料，即刻发生荧光去除或淬灭，来分析和观察线粒体膜通道孔活性的而经典的技
术方法。该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的。其适用于各种纯化线粒体膜通
道孔活性（瞬时或开放状态）的检测。产品严格无菌，即到即用，活体检测，分辨率高，
操作简捷，性能稳定。
技术背景
线粒体膜通道孔（mitochondrial permeability transition pore；MPTP）是由线粒体内外膜成分
构成的非特异性且钙离子依赖性通道。在细胞凋亡或坏死时，线粒体内容物通过膜通道孔释
放到胞浆中。膜通道孔的开放，显著改变线粒体的通透性。钙离子过度进入、线粒体谷胱苷
肽的氧化和活性氧族水平的增加等导致膜通道孔的持续开放，而造成细胞色素C 的释放和
线粒体膜电位的消失。钙黄绿素－AM，又称双甲亚胺二乙酸钠荧光素－乙酰氧基甲基酯【bis
（bis－carboxymethyl amino methyl fluorescein）－acetoxymethyl ester】，作为荧光探针：第
一，适宜的分子量622kd，小于1.5kd；第二，几乎不具有膜结合性；第三，不是线粒体酶
的底物；第四，容易进入细胞及其线粒体。钙黄绿素-AM 进入线粒体后，被内酯酶切离，
产生具有极性的荧光性强的钙黄绿素，被线粒体俘获。同时线粒体外的钙黄绿素通过离心去
除或受到其淬灭剂钴离子的淬灭。一旦线粒体膜通道孔瞬时开放，钙黄绿素释放出线粒体外，
由于离心处理或被钴离子淬灭。线粒体内钙黄绿素荧光的变化，表明膜通道孔的开放状态。
产品内容
染色液（Reagent A） X 微升
中和液（Reagent B） X 毫升
保存液（Reagent C） X 毫升
说明书1 份
保存方式
保存染色液（Reagent A）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里；有效保证
6 个月
用户自备
96 孔酶标板：用于线粒体荧光分析的容器
1.5 毫升离心管：用于线粒体染色的容器
载波片/盖玻片：用于线粒体样品存放后荧光分析
微型台式离心机：用于沉淀线粒体
培养箱：用于染色孵育
（共聚焦）荧光显微镜：用于线粒体荧光分析
荧光分光光度仪或酶标仪：用于线粒体荧光定量分析
实验步骤
一、直接法
1． 准备好待测的纯化线粒体样品
2． 移取100 微升线粒体样品（总量为2 毫克）到1.5 毫升离心管
3． 加入X 微升染色液（Reagent A），混匀
4． 放进37℃细胞培养箱里孵育15 分钟，避免光照
5． 放进4℃微型台式离心机离心5 分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf
5415）
6． 小心抽去上清液
7． 加入X 微升37℃预热的保存液（Reagent C），混匀颗粒群
8． 放进4℃微型台式离心机离心5 分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf
5415）
9． 小心抽去保存液（Reagent C）
10．小心加入X 微升37℃预热的保存液（Reagent C），混匀颗粒群
11． 选择下列方式之一进行操作：
（A）使用（共聚焦）荧光显微镜观察（定性检测）：
1）移取10 微升上述悬液到载波片上，盖上盖玻片
2）激发波长488nm，散发波长505nm――
绿色荧光减弱，表明膜通道孔活性（MPTP）增强
（B） 或使用荧光分光光度仪检测（定量检测）：
1）移取100 微升上述悬液到100 微升比色杯或96 孔酶标板
2）即刻放进荧光分光光度仪：激发波长488nm，散发波长505nm――
RFU 降低，表明膜通道孔活性（MPTP）增强
二、间接法
实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的染色液（Reagent A）置入冰槽里融化，中和液
（Reagent B）放进37℃恒温水槽里预热。然后移出10 微升染色液（Reagent A）到新的1.5
毫升离心管，加入100 微升中和液（Reagent B），混匀后，标记为染色工作液，置入暗室里。
然后进行下列操作。
1． 准备好待测的纯化线粒体样品
2． 移取100 微升线粒体样品（总量为2 毫克）到1.5 毫升离心管
3． 放进4℃微型台式离心机离心5 分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf
5415）
4． 小心抽去上清液
5． 加入X 微升含有染色液（Reagent A）和中和液（Reagent B）的染色工作液，充分混
匀
6． 放进37℃细胞培养箱里孵育15 分钟，避免光照
7． 选择下列方式之一进行操作：
a) 使用（共聚焦）荧光显微镜观察（定性检测）：
1）移取10 微升上述细胞悬液到载波片上，盖上盖玻片（每隔5 分钟检测一次，持续30 分
钟）
2）激发波长488nm，散发波长505nm――绿色荧光减弱，表明膜通道孔活性（MPTP）增
强
b) 或使用荧光分光光度仪检测（定量检测）：
1） 移取100 微升上述悬液到100 微升比色杯或96 孔酶标板
2） 即刻放进荧光分光光度仪（每隔5 分钟检测一次，持续30 分钟）：激发波长488nm，
散发波长505nm――RFU 降低，表明膜通道孔活性（MPTP）增强
注意事项
1． 本产品为20 次操作
2． 操作时，须戴手套
3． 染色前，所有试剂溶液，除染色液（Reagent A）外，需37℃预热
4． 建议染色完成后，即刻进行荧光检测分析
5． 孵育时，必须避免光照
6． 本产品友好使用于双重染色或重叠染色
7． 如果不具备505nm 散发波长的滤波器，可以使用505nm 至530nm 中的任一波长
8． 如果膜通道孔为瞬时开放（transient），则荧光缓慢且自发降低
9． 本公司提供膜通道孔抑制剂：0.2 毫摩尔环胞素A（cyclosporine A），维护荧光完整
10．本公司提供系列线粒体分析试剂产品
质量标准
1． 本产品经鉴定性能稳定
2． 本产品经鉴定荧光清晰