3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)活性终点比色法定量检测试剂盒 产品说明书 主要用途 3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)活性终点比色法定量检测试剂是一种旨在通过3-磷酸甘油磷酸激酶和3- 磷酸甘油醛脱氢酶酶偶联反应系统中,伴随的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷(NADH)氧化后峰值的降 低,即采用比色法来测定样品中酶活性的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。 其适用于各种细胞、组织、血液等裂解悬液样品3-磷酸甘油醛脱氢酶的总活性检测。产品严格无菌,即到 即用,操作简捷,性能稳定。 技术背景 3-磷酸甘油醛脱氢酶(Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase;GAPDH;EC1.2.1.12)是一种四聚体的 酶蛋白,参与催化糖酵解,分解葡萄糖分子,为机体提供能量和碳分子。同时具有转录激活、凋亡启动等 功能。3-磷酸甘油醛脱氢酶存在于所有生物体的细胞浆中,而作为看家基因,常用于RNA和蛋白表达分析 的内参标准。通过3-磷酸甘油磷酸激酶(3-phosphoglyceric phosphokinase;3-PGK)和3-磷酸甘油醛脱氢酶 酶偶联反应系统,首先底物3-磷酸甘油(3-phosphoglyceric acid;3-PGA)受到3-磷酸甘油磷酸激酶催化磷 酸化反应,产生1,3-二磷酸甘油(glycerate-1,3-diphosphate);进而由3-磷酸甘油醛脱氢酶的作用,产生3-磷 酸甘油醛(Glyceraldehyde-3-Phosphate;G-3-P),同时其辅酶因子还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(reduced nicotinamide adenine dinucleotide;β-NADH)转化为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(reduced nicotinamide adenine dinucleotide;β-NAD),通过测定吸光值的变化(340nm 波长),来定量分析3-磷酸甘油醛脱氢酶 的总活性。其反应系统为: 产品内容 缓冲液(Reagent A) 毫升 反应液(Reagent B) 微升 底色液(Reagent C) 微升 阴性液(Reagent D) 微升 产品说明书1 份 保存方式 保存在-20℃冰箱里,反应液(Reagent B)和底色液(Reagent C)避免光照;有效保证6 月 用户自备 酶标板:用于比色的容器 酶标仪:用于样品比色分析 2 实验步骤 一、测定准备 1. 开启并设定好分光光度仪(温度为25℃):波长340nm,并置零 2. 从-20℃冰箱里取出试剂,置于冰槽里融化;底色液(Reagent C)避免光照 3. 缓冲液(Reagent A)室温下均衡温度 二、活性测定 1. 在96 孔酶标板上做好相应标记:背景对照和样品 2. 分别移取xx 微升缓冲液(Reagent A)到96 孔板中 3. 分别加入xx 微升反应液(Reagent B) 4. 分别加入xx 微升底色液(Reagent C) 5. 轻轻摇动96 孔酶标板 6. 在25℃温度下孵育3 分钟 7. 分别加入xx 微升阴性液(Reagent D)或待测样品(20 微克蛋白)到相应孔中(注意:样品须清澈) 8. 轻轻摇动酶标板 9. 在25℃温度下孵育10 分钟 10.即刻放进酶标仪检测 11.活性计算 注意事项 1. 本产品为50 次操作,包括背景对照 2. 操作时,须戴手套 3. 系统操作过程中,背景测定只需1 次 4. 样品须澄清,至关重要 5. 孵育完成后即刻比色测定 6. 测定值由低到高变化;测定持续10 分钟 7. 比色测定后,比色皿须清洗* 8. 建议待测样本蛋白浓度为20 微克/5 微升 9. 如果待测样品浓度过高或过低,可以调整样品浓度 10.葡萄糖-6-磷酸脱氢酶单位活性定义为:在25℃,pH 7.6 条件下,每分钟内能够转化1 微摩尔3-磷酸甘 油至3-磷酸甘油醛所需的酶量作为一个活性单位 11.本公司提供系列医学生化经典分析试剂产品 质量标准 1. 本产品经鉴定性能稳定 2. 本产品经鉴定检测敏感 |