血液S腺苷同型半胱氨酸（SAH或AdoHcy）酶连续循环比色法定量检测试剂盒

产品说明书

主要用途

血液S腺苷同型半胱氨酸（SAH或AdoHcy）酶连续循环比色法定量检测试剂是一种旨在通过腺苷同型半胱氨酸核苷酶、腺嘌呤脱氨酶和黄嘌呤氧化酶反应系统中生成过氧化氢，使用显色染料和过氧化酶后，产生醌亚胺产物吸光峰值的变化，即采用比色法来测定血液裂解样品中S腺苷同型半胱氨酸含量的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于动物和人体血液样品（血浆等）S腺苷同型半胱氨酸的定量检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。

技术背景

S腺苷同型半胱氨酸（S-adenosyl-L-homocysteine；SAH或AdoHcy），化学全称为5’-S-(3-Amino-3-carboxy propyl)-5’-thioadenosine）是一碳代谢和细胞甲基化反应的重要分子之一，也是半胱氨酸合成的中间产物。其分子量384.41，分子式为C₁₄H₂₀N₆O₅S。SAH对于甲基转移酶具有高度的亲和力。SAH通过S-腺苷甲硫氨酸（S-Adenosylmethionine；SAM或AdoMet）去甲基化产生。SAH是评价细胞甲基化潜力和代谢状况的重要指标。机体内的SAH含量显著低于SAM。一旦SAH含量升高，即SAM/SAH比例降低，则引起DNA甲基化不足，染色体构像改变，抑制细胞甲基转移酶活力，干扰同型半胱氨酸和腺嘌呤的清除，进一步导致基因表达和信号传导异常，以及免疫缺陷等。基于底物S腺苷同型半胱氨酸（S-adenosylhomocysteine；AdoHcy），快速被腺苷同型半胱氨酸核苷酶（AdoHcy nucleosidase）分解为S-核糖同型半胱氨酸（S-ribosylhomo cysteine）和腺嘌呤（adenine），腺嘌呤由腺嘌呤脱氨酶（Adenine deaminase）产生次黄嘌呤，通过黄嘌呤氧化酶（xanthine oxidase）催化，生成过氧化氢，然后借助过氧化酶（peroxidase）的作用，与对羟基苯甲酸（p-hydroxybenzoic acid）和氨基安替比林（4-aminoantipyrine）反应，形成有色醌亚胺（quinoneimine），通过其吸收峰值的变化（510nm波长），来定量分析S腺苷同型半胱氨酸的含量。其反应系统为：

产品内容

保存方式

保存去干扰液（Reagent A）在4℃冰箱里，其余的保存在－20℃冰箱里；底物液（Reagent C）避免光照；有效保证6月

用户自备

抗凝管：用于血液采集的容器

1.5毫升离心管：用于样品操作和保存的容器

微型台式离心机：用于样品操作

恒温培养箱或水槽：用于反应孵育

比色皿或96孔板：用于比色的容器

分光光度仪或酶标仪：用于比色分析

实验步骤

• 样品准备

• 准备好肝素抗凝管
• 抽取1毫升血液，置于抗凝管里
• 放进4℃微型台式离心机离心10分钟，速度为700g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取上层黄色液体到新的1.5毫升离心管――此为血浆成分（注意：避免触碰白色液体层）
• （选择步骤）移取10微升进行蛋白定量测定 
• 移取200微升血浆到新的1.5毫升离心管
• 加入xx微升去干扰液（Reagent A），混匀
• 放进冰槽里孵育30分钟
• 放进4℃微型台式离心机离心15分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 移取上清液到新的1.5毫升离心管
• 即刻置于冰槽里备用或放进－70℃冰箱里保存

• 测定准备

• 开启并设定好分光光度仪（温度为37℃）：波长510nm，并置零 
• 从－20℃冰箱里取出试剂，置于冰槽里融化；底物液（Reagent C）避免光照
• 缓冲液（Reagent B）室温下均衡温度

• 背景对照测定

• 移取xx微升缓冲液（Reagent B）到新的比色皿
• 加入xx微升阴性液（Reagent E）
• 加入xx微升底物液（Reagent C）
• 加入xx微升反应液（Reagent D） 
• 上下倾倒数次，混匀
• 放进37℃恒温培养箱或水浴孵育20分钟
• 即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照 

• 样品测定

• 加入xx微升缓冲液（Reagent B）
• 加入20微升待测样品（100微克蛋白）（注意：样品须清澈）
• 加入xx微升底物液（Reagent C）
• 加入xx微升反应液（Reagent D）
• 上下倾倒数次，混匀
• 放进37℃恒温培养箱或水浴孵育20分钟
• 即刻放进分光光度仪检测，此为样品读数 

五、计算样品浓度

• 酶标仪测定

• 在96孔板上做好相应标记：背景对照和样品
• 分别加入xx微升缓冲液（Reagent B）
• 分别加入xx微升阴性液（Reagent E）或待测样品（100微克蛋白）到相应孔里（注意：样品须清澈）
• 分别加入xx微升底物液（Reagent C）
• 分别加入xx微升反应液（Reagent D）
• 轻轻摇动96孔板
• 放进37℃恒温培养箱孵育20分钟
• 即刻放进酶标仪检测
• 浓度计算：

注意事项

• 本产品为20次操作，包括背景对照
• 如果检测红细胞中的SAH浓度，建议使用细胞S腺苷同型半胱氨酸（SAH或AdoHcy）酶连续循环比色法定量检测试剂盒
• 使用1厘米光径的比色皿
• 操作时，须戴手套
• 系统操作过程中，背景测定只需1次
• 样品中避免使用DTT、巯基乙醇、TCEP、EDTA等
• 建议使用血浆样品为佳
• 样品须澄清，至关重要
• 测定值由低到高变化
• 比色测定后，比色皿须清洗*
• 建议待测样本蛋白浓度为100微克/20微升
• 如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度
• 参考值：人体血浆SAM约155纳摩尔/升；SAH约20纳摩尔/升；SAM/SAH比值约为8.5
• 本公司提供系列医学生化检测试剂产品

质量标准

• 本产品经鉴定性能稳定
• 本产品经鉴定检测敏感