HL10118.3 v.A

细胞/组织高质纯化溶酶体（lysosome）分离试剂盒产品说明书

主要用途

细胞/组织高质纯化溶酶体（lysosome）分离试剂是一种旨在从动物细胞或组织中分离出活性完整而高度纯化的溶酶体细胞器的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。适合于动物软组织（肝或脑组织）和培养细胞的溶酶体的制备。产品不含污染性蛋白酶和核酶，即到即用，性能稳定，分离产量和纯度俱佳。

技术背景

溶酶体（lysosome）是一种普遍存在于真核细胞中的细胞器，含有酸性水解酶，例如酯酶、淀粉酶、蛋白酶、核酶等，分解各种细胞残渣和废弃物质，包括过多的或破损的其它细胞器、食物颗粒、吞噬的细菌和病毒等。其大小为0.5至1.5微米，球圆形，溶酶体内pH为5.0左右。溶酶体功能异常会引起溶酶体贮积症（1ysosomal storage disorders；LSDs），例如家族性痴呆病（Tay-sachs disease）和庞贝氏症 （Pompe’s disease）。溶酶体细胞器的分离是现代细胞生物学研究的zui常用的手段之一。从任何组织或细胞分离溶酶体的技术方法基本上采用：*，通过机械或化学方法破裂细胞；第二，通过低速差速离心去除残渣碎屑和巨大细胞器；第三，通过高速差速离心获得溶酶体；甚至，第四，可以通过等密度离心获得纯度更高的溶酶体。 

产品内容

清理液（Reagent A）   毫升

裂解液（Reagent B）   毫升

净化液（Reagent C）   毫升

强化液（Reagent D）   毫升

分离液（Reagent E）   毫升

高纯液A（Reagent F）   毫升

高纯液B（Reagent G）   毫升

高纯液C（Reagent H）   毫升

高纯液D（Reagent I）   毫升

高纯液E（Reagent J）   毫升

保存液（Reagent K）   毫升

产品说明书   1份

保存方式

保存净化液（Reagent C）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里，有效保证6月

用户自备

HANK平衡盐缓冲溶液（12028）或PBS缓冲溶液（12033）：用于清理细胞

胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（12024）：用于细胞脱离

*细胞培养液（12052）：用于细胞处理所需的培养基

15毫升锥形离心管：用于样品操作的容器

50毫升锥形离心管：用于样品操作的容器

1.5毫升离心管：用于样品操作的容器

6毫升超速离心管：用于超高速离心的容器

4℃台式离心机：用于沉淀细胞

4℃超速离心机：用于分离细胞器成分

DOUNCE匀浆器：用于裂解组织细胞

实验步骤

• 动物软组织溶酶体分离（组织匀浆法）

实验开始前，将－20℃冰箱里的净化液（Reagent C）取出冻融，然后移取xx毫升净化液（Reagent C）和xx毫升的裂解液（Reagent B）到15毫升锥形离心管里，混匀后，标记为裂解工作液，放进冰槽里备用。然后进行下列操作。

• 手术取出动物组织，并秤重以确定1克组织重量（实验前使动物空腹12至24小时）
• （选择步骤）放进预冷的50毫升锥形离心管
• （选择步骤）加入xx毫升清理液（Reagent A）清洗1次
• 即刻用刀片切碎组织
• 放进一个预冷的15毫升锥形离心管
• 加入xx毫升预冷的裂解工作液
• 涡旋震荡5秒，充分混匀
• 即刻放入预冷的DOUNCE匀浆器
• 在冰槽里用匀浆棒匀化组织（约60至80下）（注意：参见注意事项7）
• 将所有组织匀浆物移入15毫升锥形离心管
• 放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为1000g
• 小心移取上清液到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管——此步骤去除细胞核和未溶解的细胞
• 放进4℃超速离心机离心10分钟，速度为3000g
• 小心移取5毫升上清液到新的15毫升离心管
• 放进4℃超速离心机离心20分钟，速度为20000g
• 小心抽去上清液，保留沉淀颗粒——此步骤获得溶酶体粗提沉淀物
• 加入xx毫升分离液（Reagent E），混匀沉淀颗粒群
• 准备1个6毫升超速离心管
• 移取xx毫升高纯液A（Reagent F）到6毫升超速离心管底部（注意：使用前摇匀高纯液A(Reagent F)）
• 轻轻加上xx毫升高纯液B（Reagent G）在高纯液A（Reagent F）的上面，避免震动（注意：使用前摇匀高纯液B(Reagent G)）
• 轻轻加上xx毫升高纯液C（Reagent H）在高纯液B（Reagent G）的上面，避免震动（注意：使用前摇匀高纯液C(Reagent H)）
• 轻轻加上xx毫升高纯液D（Reagent I）在高纯液C（Reagent H）的上面，避免震动（注意：使用前摇匀高纯液D(Reagent I)）
• 轻轻加上xx毫升高纯液E（Reagent J）在高纯液D（Reagent I）的上面，避免震动（注意：使用前摇匀高纯液E(Reagent J)）
• 轻轻加上xx毫升上述溶酶体混匀液在高纯液E（Reagent J）的上面，避免震动
• 放进4℃超速离心机离心120分钟，速度为145000g
• 小心收集顶部溶酶体样品带到15毫升锥形离心管——此步骤获得高纯溶酶体样品
• 加入xx毫升预冷的保存液（Reagent K）
• 放进4℃超速离心机再次离心20分钟，速度为20000g
• 小心抽去上清液
• 加入xx微升保存液（Reagent K），充分混匀
• 即刻移入1.5毫升离心管，放进－70℃冰箱里

二、动物软组织溶酶体分离（化学处理法）

实验开始前，将－20℃冰箱里的净化液（Reagent C）取出冻融，然后移取xx毫升净化液（Reagent C）和xx毫升的裂解液（Reagent B）到15毫升锥形离心管里，混匀后，标记为裂解工作液，放进冰槽里备用。然后进行下列操作。

• 手术取出动物组织，并秤重以确定1克组织重量（实验前使动物空腹12至24小时）
• （选择步骤）放进预冷的50毫升锥形离心管
• （选择步骤）加入xx毫升清理液（Reagent A）清洗1次
• 移入一个液氮冻存管
• 即刻放入液氮罐过夜
• 次日从液氮罐里取出，即刻（zui快速度）碾碎组织成粉末（注意：切莫使组织冻融）
• 放进一个15毫升锥形离心管
• 加入xx毫升预冷的裂解工作液
• 涡旋震荡5秒，充分混匀
• 在冰槽里孵育2分钟，期间涡旋震荡5秒一次
• 加入xx微升预冷的强化液（Reagent D）
• 涡旋震荡5秒，充分混匀
• 在冰槽里孵育5分钟，期间涡旋震荡5秒二次（注意：参见注意事项8）
• 加入xx毫升预冷的保存液（Reagent K），轻轻摇动试管混匀
• 放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为1000g
• 小心移取上清液到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管——此步骤去除细胞核和未溶解的细胞
• 放进4℃超速离心机离心10分钟，速度为3000g
• 小心移取10毫升上清液到新的15毫升离心管
• 放进4℃超速离心机离心20分钟，速度为20000g
• 小心抽去上清液，保留沉淀颗粒——此步骤获得溶酶体粗提沉淀物
• 加入xx毫升分离液（Reagent E），混匀沉淀颗粒群
• 准备1个6毫升超速离心管
• 移取xx毫升高纯液A（Reagent F）到6毫升超速离心管底部（注意：使用前摇匀高纯液A(Reagent F)）
• 轻轻加上xx毫升高纯液B（Reagent G）在高纯液A（Reagent F）的上面，避免震动（注意：使用前摇匀高纯液B(Reagent G)）
• 轻轻加上xx1毫升高纯液C（Reagent H）在高纯液B（Reagent G）的上面，避免震动（注意：使用前摇匀高纯液C(Reagent H)）
• 轻轻加上xx毫升高纯液D（Reagent I）在高纯液C（Reagent H）的上面，避免震动（注意：使用前摇匀高纯液D(Reagent I)）
• 轻轻加上xx毫升高纯液E（Reagent J）在高纯液D（Reagent I）的上面，避免震动（注意：使用前摇匀高纯液E(Reagent J)）
• 轻轻加上xx毫升上述溶酶体混匀液在高纯液E（Reagent J）的上面，避免震动
• 放进4℃超速离心机离心120分钟，速度为145000g
• 小心收集顶部溶酶体样品带到15毫升锥形离心管——此步骤获得高纯溶酶体样品
• 加入xx毫升预冷的保存液（Reagent K）
• 放进4℃超速离心机再次离心20分钟，速度为20000g
• 小心抽去上清液
• 加入xx微升保存液（Reagent K），充分混匀
• 即刻移入1.5毫升离心管，放进－70℃冰箱里

三、动物细胞溶酶体分离（细胞匀浆法）

实验开始前，将－20℃冰箱里的净化液（Reagent C）取出冻融，然后移取xx毫升净化液（Reagent C）和xx毫升的裂解液（Reagent B）到15毫升锥形离心管里，混匀后，标记为裂解工作液，放进冰槽里备用。然后进行下列操作。

• 准备5至10瓶75cm²细胞培养瓶的细胞（10⁸），直至细胞生长铺满整个培养表面
• 分别加入10毫升用户自备的HANK平衡盐缓冲溶液或PBS缓冲溶液到每个细胞培养瓶，覆盖培养瓶表面，然后抽去
• 重复实验步骤2一次
• 加入3毫升用户自备的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，铺满整个细胞生长表面
• 置入37℃培养箱3分种
• 轻轻手击震动培养瓶，使细胞脱落，
• 分别加入10毫升用户自备的*细胞培养液
• 移入一个50毫升锥形离心管
• 放进台式离心机离心10分钟，速度为200g
• 小心抽去上清液
• 加入xx毫升预冷的清理液（Reagent A），混匀细胞
• 放进台式离心机离心10分钟，速度为300g
• 小心抽去上清液
• 加入xx毫升预冷的裂解工作液
• 涡旋震荡5秒，充分混匀细胞颗粒群
• 即刻放进预冷的DOUNCE匀浆器
• 在冰槽里用匀浆棒匀化细胞（约20至40下）（注意：参见注意事项7）
• 将所有细胞匀浆物移入15毫升锥形离心管
• 放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为1500g
• 小心移取上清液到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管——此步骤去除细胞核和未溶解的细胞
• 放进4℃超速离心机离心10分钟，速度为3000g
• 小心移取5毫升上清液到新的15毫升离心管
• 放进4℃超速离心机离心20分钟，速度为20000g
• 小心抽去上清液，保留沉淀颗粒——此步骤获得溶酶体粗提沉淀物
• 加入xx毫升分离液（Reagent E），混匀沉淀颗粒群
• 准备1个6毫升超速离心管
• 移取xx毫升高纯液A（Reagent F）到6毫升超速离心管底部（注意：使用前摇匀高纯液A(Reagent F)）
• 轻轻加上xx毫升高纯液B（Reagent G）在高纯液A（Reagent F）的上面，避免震动（注意：使用前摇匀高纯液B(Reagent G)）
• 轻轻加上xx毫升高纯液C（Reagent H）在高纯液B（Reagent G）的上面，避免震动（注意：使用前摇匀高纯液C(Reagent H)）
• 轻轻加上xx毫升高纯液D（Reagent I）在高纯液C（Reagent H）的上面，避免震动（注意：使用前摇匀高纯液D(Reagent I)）
• 轻轻加上xx毫升高纯液E（Reagent J）在高纯液D（Reagent I）的上面，避免震动（注意：使用前摇匀高纯液E(Reagent J)）
• 轻轻加上xx毫升上述溶酶体混匀液在高纯液E（Reagent J）的上面，避免震动
• 放进4℃超速离心机离心120分钟，速度为145000g
• 小心收集顶部溶酶体样品带到15毫升锥形离心管——此步骤获得高纯溶酶体样品
• 加入xx毫升预冷的保存液（Reagent K）
• 放进4℃超速离心机再次离心20分钟，速度为20000g
• 小心抽去上清液
• 加入xx微升保存液（Reagent K），充分混匀
• 即刻移入1.5毫升离心管，放进－70℃冰箱里

四、动物细胞溶酶体分离（化学处理法）

实验开始前，将－20℃冰箱里的净化液（Reagent C）取出冻融，然后移取xx毫升净化液（Reagent C）和xx毫升的裂解液（Reagent B）到15毫升锥形离心管里，混匀后，标记为裂解工作液，放进冰槽里备用。然后进行下列操作。

• 准备5至10瓶75cm²细胞培养瓶的细胞（10⁸），直至细胞生长铺满整个培养表面
• 分别加入10毫升用户自备的HANK平衡盐缓冲溶液或PBS缓冲溶液到每个细胞培养瓶，覆盖培养瓶表面，然后抽去
• 重复实验步骤2一次
• 加入3毫升用户自备的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，铺满整个细胞生长表面
• 置入37℃培养箱3分种
• 轻轻手击震动培养瓶，使细胞脱落
• 分别加入10毫升用户自备的*细胞培养液
• 移入一个50毫升锥形离心管
• 放进台式离心机离心10分钟，速度为200g
• 小心抽去上清液
• 加入xx毫升预冷的清理液（Reagent A）
• 放进台式离心机离心10分钟，速度为300g
• 小心抽去上清液
• 加入xx毫升预冷的裂解工作液
• 涡旋震荡5秒，充分混匀
• 在冰槽里孵育2分钟，期间涡旋震荡5秒一次
• 加入xx微升预冷的强化液（Reagent D）
• 涡旋震荡5秒，充分混匀
• 在冰槽里孵育5分钟，期间涡旋震荡5秒二次（注意：参见注意事项8）
• 加入xx毫升预冷的保存液（Reagent K），轻轻摇动试管混匀
• 放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为1500g
• 小心移取上清液到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管——此步骤去除细胞核和未溶解的细胞
• 放进4℃超速离心机离心10分钟，速度为3000g
• 小心移取10毫升上清液到新的15毫升离心管
• 放进4℃超速离心机离心20分钟，速度为20000g
• 小心抽去上清液，保留沉淀颗粒——此步骤获得溶酶体粗提沉淀物
• 加入xx毫升分离液（Reagent E），混匀沉淀颗粒群
• 准备1个6毫升超速离心管
• 移取xx毫升高纯液A（Reagent F）到6毫升超速离心管底部（注意：使用前摇匀高纯液A(Reagent F)）
• 轻轻加上xx毫升高纯液B（Reagent G）在高纯液A（Reagent F）的上面，避免震动（注意：使用前摇匀高纯液B(Reagent G)）
• 轻轻加上xx毫升高纯液C（Reagent H）在高纯液B（Reagent G）的上面，避免震动（注意：使用前摇匀高纯液C(Reagent H)）
• 轻轻加上xx毫升高纯液D（Reagent I）在高纯液C（Reagent H）的上面，避免震动（注意：使用前摇匀高纯液D(Reagent I)）
• 轻轻加上xx毫升高纯液E（Reagent J）在高纯液D（Reagent I）的上面，避免震动（注意：使用前摇匀高纯液E(Reagent J)）
• 轻轻加上xx毫升上述溶酶体混匀液在高纯液E（Reagent J）的上面，避免震动
• 放进4℃超速离心机离心120分钟，速度为145000g
• 小心收集顶部溶酶体样品带到15毫升锥形离心管——此步骤获得高纯溶酶体样品
• 加入xx毫升预冷的保存液（Reagent K）
• 放进4℃超速离心机再次离心20分钟，速度为20000g
• 小心抽去上清液
• 加入xx微升保存液（Reagent K），充分混匀
• 即刻移入1.5毫升离心管，放进－70℃冰箱里

注意事项

• 本产品为10次（1克动物组织或 10⁸细胞）操作
• 所有操作均须严格在4℃或以下状态进行
• 操作时，须戴手套
• 操作时，须无菌操作，避免污染母液，尤其是裂解液（Reagent B）、分离液（Reagent E）和高纯液系列
• 建议使用足够的样品量
• 建议严格控制操作时间
• 通常匀化次数为40至80下（或细胞颗粒群/组织块状消失为止）达到80％的细胞裂解为理想状态，但不同的组织或细胞类型会存在差异。用户可以通过显微镜观察3微升匀浆物的细胞裂解程度：完整细胞呈现发亮的圆环。低于50％可以增加匀化次数
• 通常孵育5分钟（不宜超过5分钟）达到80％的细胞裂解为理想状态，但不同的组织或细胞类型会存在差异。用户可以通过显微镜观察3微升裂解物的细胞裂解程度：完整细胞呈现发亮的圆环。低于50％可以增加孵育时间和涡旋震荡次数
• 对于难以裂解的细胞，例如HeLa细胞，采用物理匀浆法是优先推荐的技术处理

10． 使用高纯液前，须摇匀后加入 

• 根据超速离心管的大小调整高纯液的使用量或在样品上面加上石蜡油填满
• 通常1克动物组织或 10⁸细胞的溶酶体含量为300微克左右溶酶体蛋白

13． 本产皮可以获得99％以上纯度的溶酶体  

• 溶酶体标志酶活性测定，建议使用通用型N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（NAG）活性比色法定量检测试剂盒—70031.1和纯化溶酶体酸性磷酸酶活性比色法定量检测试剂盒—50318.3 
• 溶酶体形态和功能染色，建议使用细胞溶酶体形态染色试剂盒—10121和纯化溶酶体功能中性红检测试剂盒—10323 
• 本公司提供系列溶酶体分析试剂产品

质量标准

• 本产品经鉴定性能稳定
• 本产品经鉴定分离的溶酶体内外膜完整
• 本产品经鉴定分离的溶酶体维持正常活性
• 本产品经鉴定不含污染性蛋白酶和核酶