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细胞激酶活性光谱法定量检测试剂盒说明书
点击次数:61 发布时间:2022-12-19

细胞 GSK3α激酶活性光谱法定量检测试剂盒产品说明书

主要用途

细胞 GSK3α激酶活性光谱法定量检测试剂是一种旨在通过多肽底物,在 GSK3β抑制剂的存在下,受到GSK3α磷酸化后,进而由丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶连续循环法反应系统,测定产生 ADP 过程中,伴随的还原型腺嘌呤二核苷酸(NADH)的氧化反应, 即采用光谱法测定其氧化后峰值的变化,以分析细胞裂解样品中 GSK3α特异活性的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种细胞裂解萃取液样品(动物、人体)、部分或纯化酶样品中 GSK3α激酶的定量检测,以及抑制剂和激活剂的筛选。产品严格无菌,即到即用,操作简捷,性能稳定,高度敏感。

技术背景

糖原合成酶激酶3(glycogen synthase kinase 3;GSK3;EC 2.7.11.26)属于激酶(serine/threonine protein kinase)家属成员之一。其目标蛋白为糖原合成酶和活化T细胞核因子(nuclear factor of activated Tlymphocytes;NFAT),进行磷酸化后,抑制其功能,同时调控细胞对DNA损伤的反应、生物发育的组织排列(tissue patterning)、蛋白合成、细胞分化和繁殖等。糖原合成酶激酶3从酵母到人体高度进化保留,果蝇中GSK3同源蛋白为Shaggy(Zeste White 3),在Wnt信号通路中磷酸化β-catenin,导致后者泛素化后降解,防止β-catenin进入细胞核激活转录因子。糖原合成酶激酶3本身受到胰岛素、生长因子、蛋白激酶B(proteinkinase B)/v-akt鼠源胸腺瘤病毒肿瘤基因同源体(akt)调控。糖原合成酶激酶3分成两种异构体:糖原合成酶激酶3α和β,其结构相似,功能不同。糖原合成酶激酶3α有一段较长且富含(Glycine-rich)的N端。糖原合成酶激酶3α与β-类淀粉物-40/42多肽(beta-amyloid-40/ 42 peptides)大量产生有关。其功能异常将导致阿兹罕默综合征等疾病。其磷酸化目标序列为RRAAEELDSRAGSPQL。基于底物RRAAEELDSRAGSPQL,在ATP和GSK3β抑制剂噻二唑烷酮-8(thiadiazolidinone-8;TDZD-8)的存在下,受到GSK3α激酶的磷酸化,获得产物磷酸化多肽,进而通过丙酮酸激酶(pyruvate kinase;PK)和乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase;LDH)反应系统中,还原型腺嘌呤二核苷酸(reduced nicotinamide adenine dinucleotide;NADH)转化为氧化型腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide;NAD),其吸光峰值的变化(340nm),来定量分析糖原合成酶激酶3α的特异活性。其反应方式为: 产品内容

清理液(Reagent A) 毫升

裂解液(Reagent B) 毫升

缓冲液(Reagent C) 毫升

酶促液(Reagent D) 微升

反应液(Reagent E) 微升

底物液(Reagent F) 微升

阴性液(Reagent G) 微升

产品说明书 1 份

保存方式

保存清理液(Reagent A)在 4℃冰箱里;其余的保存在-20℃冰箱里,严格避免光照和反复冻融;有效保证6

用户自备

GSK3α激酶:用于抑制剂筛选

1.5 毫升离心管:用于样品保存的容器

15 毫升锥形离心管:用于样品处理的容器

细胞刮脱棒:用于贴壁细胞脱离

(微型)台式离心机:用于组织预处理

比色皿或酶标板:用于光谱分析操作的容器

分光光度仪或酶标仪:用于样品光谱分析

实验步骤

一、 待测样品准备

1. 准备好 25cm2细胞培养瓶或 60mm 细胞培养皿的待测培养细胞(1 至 5 X 106细胞)

2. 小心加入 xx 毫升清理液(Reagent A),覆盖生长表面

3. 小心抽去清理液

4. 使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞(注意:避免使用消化)

5. 加入 xx 毫升清理液(Reagent A),混匀细胞

6. 移入到预冷的 15 毫升锥形离心管(注意:悬浮细胞从这一步骤开始)

7. 放进 4℃台式离心机离心 5 分钟,速度为 300g

8. 小心抽去上清液

9. 加入 xx 微升裂解液(Reagent B),充分混匀

10.转移到预冷的 1.5 毫升离心管

11.强力涡旋震荡 15 秒

12.置于冰槽里孵育 30 分钟

13.放进 4℃微型台式离心机离心 5 分钟,速度为 16000g(或 13000RPM,例如 eppendorf 5415)

14.小心移取 500 微升上清液到新的预冷的 1.5 毫升离心管

15.移取 10 微升进行蛋白定量检测(注意:建议使用 Bradford 蛋白质浓度定量试剂盒-30030.1)

16.即刻放进-70℃保存或置于冰槽里继续后续操作

二、 测定准备

1. 准备好待测样品(例如细胞裂解悬液等),置于冰槽里

2. 设定好分光光度仪(温度为 30℃):波长为 340nm,间隔 1 分钟,读数 6 次(共 5 分钟),并置零

3. 缓冲液(Reagent C)室温下均衡温度

三、 背景对照测定

1. 移取 xx 微升缓冲液(Reagent C)到新的比色皿

2. 加入 xx 微升酶促液(Reagent D)

3. 加入 xx 微升反应液(Reagent E)

4. 加入 xx 微升底物液(Reagent F)

5. 放进 30℃培养箱里静置 3 分钟

6. 加入 xx 微升阴性液(Reagent G)

7. 上下倾倒数次,混匀(限定在 3 秒之内)

8. 即刻放进分光光度仪检测,此为背景空对照:340 波长读数 0 分钟 -340 波长读数 5 分钟

四、 样品测定

1. 移取 xx 微升缓冲液(Reagent C)到新的比色皿

2. 加入 xx 微升酶促液(Reagent D)

3. 加入 xx 微升反应液(Reagent E)

4. 加入 xx 微升底物液(Reagent F)

5. 放进 30℃培养箱里静置 3 分钟

6. 加入 5 微升待测样品(注意:50 微克细胞裂解蛋白;样品须溶解)

7. 上下倾倒数次,混匀(限定在 3 秒之内)

8. 即刻放进分光光度仪检测,此为样品总活性读数:340 波长读数 0 分钟 -340 波长读数 5 分钟

五、 计算样品活性

六、 酶标板测定

1. 在 96 孔酶标板上做好相应标记:背景对照和样品

2. 分别移取 xx 微升缓冲液(Reagent C)到 96 孔板中

3. 分别加入 xx 微升酶促液(Reagent D)

4. 分别加入 xx 微升反应液(Reagent E)

5. 分别加入 xx 微升底物液(Reagent F)

6. 轻轻摇动 96 孔酶标板

7. 在 30℃温度下孵育 3 分钟

8. 分别加入 xx 微升阴性液(Reagent G)或待测样品(50 微克细胞裂解悬液蛋白)到相应孔中(注意:样品须清澈)

9. 轻轻摇动酶标板

10.即刻放进酶标仪检测:0 分钟读数和 5 分钟读数

11.活性计算:

七、抑制剂筛选

1. 在 96 孔酶标板上做好相应标记:背景、活性和待测抑制剂样品

2. 按下表加入试剂,进行样品预处理

内容物 空背景对照 样本背景 酶活性 待测抑制剂酶活性缓冲液(ReagentC)xx 微升 xx 微升 xx 微升 xx 微升阴性液(ReagentG)

xx 微升 xx 微升 xx 微升 ——

待测抑制剂 —— xx 微升 ―― xx 微升

用户自备的纯化酶 —— —— xx 微升(1 毫单位) xx 微升(1 毫单位)

96 孔板每孔总量 空背景对照孔

xx 微升)

样本背景孔

xx 微升)

活性孔

xx 微升)

待测抑制剂样品孔

xx 微升)

轻轻摇动酶标板,混匀,放进 30℃培养箱里孵育 30 分钟。然后进行下列操作

3. 分别移取 xx 微升缓冲液(Reagent C)到新的 96 孔板的所有孔里

4. 分别加入 xx 微升酶促液(Reagent D)

5. 分别加入 xx 微升反应液(Reagent E)

6. 分别加入 xx 微升底物液(Reagent F)

7. 轻轻摇动酶标板

8. 在 30℃温度下孵育 3 分钟

9. 加入 20 微升上述预处理的待测样品

10.即刻放进 30℃酶标仪检测:测读 30 分钟

11.抑制活性计算: 注意事项

1. 本产品为 20 次操作,包括背景操作

2. 操作时,须戴手套

3. 系统操作过程中,背景测定只需 1 次

4. 样品处理忌用磷酸缓冲溶液

5. 样品须澄清,至关重要

6. 加入样品启动反应后 3 秒内即刻光谱测定

7. 测定值由高到低变化;测定可持续 30 分钟

8. 光谱测定后,比色皿须清洗

9. 样本测定 0 分钟读数高于 5 分钟读数表明具有酶活性

10.建议待测样本蛋白浓度为 50 微克/5 微升(本公司提供 Bradford 蛋白质浓度定量试剂盒-30030.1)

11.如果待测样品浓度过高或过低,可以调整样品浓度

12.可以使用 GSK3α抑制剂 Aloisine A 作为抑制剂对照或阴性对照

13.糖原合成酶激酶 3α活性单位浓度定义:在 30℃温度下,pH 7.5 条件下,每分钟内能够氧化 1 微摩尔还原型腺嘌呤二核苷酸(NADH)所需的酶量作为一个活性单位

14.本公司提供系列蛋白激酶检测试剂产品质量标准

1. 本产品经鉴定性能稳定

2. 本产品经鉴定检测敏感 

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