免疫共沉淀服务当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。当用预先固化在argarose beads上的蛋白质A的抗体免疫沉淀A蛋白，那么与A蛋白在体内结合的蛋白质B也能一起沉淀下来。再通过蛋白变性分离，对B蛋白进行检测，进而证明两者间的相互作用。
这种方法得到的目的蛋白是在细胞内与兴趣蛋白天然结合的，符合体内实际情况，得到的结果可信度高。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。优点
（1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；
（2）蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；
（3）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。
缺点
（1）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用；
（2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；
（3）必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。
（4）灵敏度没有亲和色谱高。
实验过程
（1）转染后24-48 h 可收获细胞，加入适量细胞裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上裂解30min, 细胞裂解液于4°C， 大转速离心30 min后取上清；
（2）取少量裂解液以备Western blot分析，剩余裂解液加1μg相应的抗体加入到细胞裂解液，4°C缓慢摇晃孵育过夜；
（3）取10μl protein A 琼脂糖珠，用适量裂解缓冲液洗3 次，每次3,000 rpm离心3 min；
（4）将预处理过的10μl protein A 琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中4°C缓慢摇晃孵育2-4h，使抗体与protein A琼脂糖珠耦联；
（5）免疫沉淀反应后，在4°C 以3,000 rpm 速度离心3 min，将琼脂糖珠离心至管底；将上清小心吸去，琼脂糖珠用1ml裂解缓冲液洗3－4次；后加入15μl的2×SDS 上样缓冲液，沸水煮5分钟；
（6）SDS-PAGE, Western blotting或质谱仪分析。
注意的问题：
（1）细胞裂解采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所有蛋白质－蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂（NP40或Triton X-100)。每种细胞的裂解条件是不一样的，通过经验确定。不能用高浓度的变性剂（0.2%SDS)，细胞裂解液中要加各种酶抑制剂，如商品化的cocktailer。
（2）使用明确的抗体，可以将几种抗体共同使用。
（3）使用对照抗体：
单克隆抗体：正常小鼠的IgG或另一类单抗
兔多克隆抗体：正常兔IgG
注意事项免疫共沉淀服务
(1) 确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的，而并非外源非特异蛋白，单克隆抗体的使用有助于避免污染的发生；
(2) 要确保抗体的特异性，即在不表达抗原的细胞溶解物中添加抗体后不会引起共沉淀；
(3) 确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中，而不是由于细胞的溶解才发生的，这需要进行蛋白质的定位来确定。 |
