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WB检测蛋白服务

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产品特点:
WB检测蛋白服务WB 是将蛋白质转移到膜上,然后利用抗体进行检测的方法。对已知表达蛋白,可用相应抗体作为一抗进行检测,对新基因的表达产物,可通过融合部分的抗体检测。

 


根据显色方法主要有以下几种:

放射自显影

底物化学发光 ECL

底物荧光 ECF

底物 DAB 呈色

 

现在常用的有底物化学发光 ECL 和底物 DAB 呈色,体同水平和实验条件的是用*种方法,目前发表文章通常是用底物化学发光 ECL。只要买现成的试剂盒就行, 操作也比较简单,原理如下(二抗用 HRP 标记):反应底物为过氧化物 + 鲁米诺,如遇到 HRP,即发光,可使胶片曝光,就可洗出条带。

 

 


 
实验常见的问题指南

 


01

参考书推荐

 

A. 对初学者看什么资料比较好?

 

解答:《抗体技术实验指南》和 Antibodies(a laboratory manual, wrote by Ed Harlow ,david lane)两本书不错。

 


02

针对样品的常见问题

 

此处内容较多,有部分答案省略,想查看更多详情,请点击【阅读原文】查看。

 

B. 做线粒体膜 UCP2 蛋白的 Western Blot(以下简写成 Western Blot),提取线粒体后冻存(未加蛋白酶抑制剂),用的博士德的一抗,开始还有点痕迹,现在越来越差,上样量已加到 120 μg,换了个 santa cloz 的一抗仍不行。是什么原因?蛋白酶抑制剂单加 PMSF 行吗?

 

解答:怀疑是样品问题,可能是:1,样品不能反复冻融;2,样品未加蛋白酶抑制剂。同时,建议检查 Western Blot 过程, 提高一抗浓度。对于加蛋白酶抑制剂来说,一般加 PMSF 就可以了,好能多加几中种蛋白酶抑制剂。

 

C. 细胞水平要做 Western Blot,多少细胞提的蛋白够 Western Blot? 

 

解答:一般地 5* 106 就足够了。

 

D. 同一样品能同时提 RNA 又提蛋白吗,这样对 Western Blot 有无影响? 

 

解答:能,没有问题,我们做过。

 

E. 同一蛋白样品能同时进行两种因子的 Western Blot 检测吗?

 

F. 如果目标蛋白是膜蛋白或是胞浆蛋白,操作需要注意什么?

 


03

抗体

 

T. 做细胞信号传导,要做磷酸化某因子 Western Blot,其二抗有何要求?

 

解答:对二抗无要求,要看你实验条件来选择,一般推荐用 HRP 标记的二抗。

 

U. 同一公司的另外抗体用这个稀释度做出来效果很好,所以没做预试,怕费时间,用什么样的稀释度比较好呢?我用的 ELL + plus 试剂盒显色。转膜过夜,一抗孵育也是过夜的,若封闭也过夜的话就要四天才看的到结果了。

 


04

滤纸、胶和膜的问题

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