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siRNA 合成服务

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siRNA 合成服务 (siRNA):是一种小RNA分子(~21-25核苷酸),由Dicer(RNAase Ⅲ家族中对双链RNA具有特异性的酶)加工而成。SiRNA是siRISC的主要成员,激发与之互补的目标mRNA的沉默。 RNA干涉(RNAinterference,RNAi)是指内源性或外源性双链RNA(dsRNA)介导的细胞内mRNA发生特异性降解,从而导致靶基因的表达

siRNA
siRNA图册
RNA干扰现象是1990年由约根森(Jorgensen)研究小组在研究查尔酮合成酶对花青素合成速度的影响时所发现,为得到颜色更深的矮牵牛花而过量表达查尔酮合成酶,结果意外得到了白色和白紫杂色的矮牵牛花,并且过量表达查尔酮合成酶的矮牵牛花中查尔酮合成酶的浓度比正常矮牵牛花中的浓度低50倍。约根森推测外源转入的编码查尔酮合成酶的基因同时抑制了花中内源查尔酮合成酶基因的表达。

1992年,罗马诺(Romano)和Macino也在粗糙链孢霉中发现了外源导入基因可以抑制具有同源序列的内源基因的表达。1995年,Guo和Kemphues在线虫中也发现了RNA干扰现象。

1998年,安德鲁·法厄(Andrew Z. Fire)等在秀丽隐杆线虫(C.elegans)中进行反义RNA抑制实验时发现,作为对照加入的双链RNA相比正义或反义RNA显示出了更强的抑制效果。从与靶mRNA的分子量比考虑,加入的双链RNA的抑制效果要强于理论上1:1配对时的抑制效果,因此推测在双链RNA引导的抑制过程中存在某种扩增效应并且有某种酶活性参与其中。并且将这种现象命名为RNA干扰。

2006年,安德鲁·法厄与克雷格·梅洛(Craig C. Mello)由于在RNAi机制研究中的贡献获得诺贝尔生理及医学奖。

原理作用/siRNA 
siRNA
siRNA图册
RNA干涉(RNAi)在实验室中是一种强大的实验工具,利用具有同源性的双链RNA(dsRNA)诱导序列特异的目标基因的沉寂,迅速阻断基因活性。siRNA在RNA沉寂通道中起中心作用,是对特定信使RNA(mRNA)进行降解的指导要素。siRNA是RNAi途径中的中间产物,是RNAi发挥效应所必需的因子。siRNA的形成主要由Dicer和Rde-1调控完成。由于RNA 病毒入侵、转座子转录、基因组中反向重复序列转录等原因,细胞中出现了dsRNA,Rde-1(RNAi缺陷基因-1)编码的蛋白质识别外源dsRNA,当dsRNA达到一定量的时候,Rde-1引导dsRNA与Rde-1编码的Dicer(Dicer是一种RNaseIII 活性核酸内切酶,具有四个结构域:Argonaute家族的PAZ结构域,III型RNA酶活性区域,dsRNA结合区域以及DEAH/DEXHRNA解旋酶活性区)结合,形成酶-dsRNA复合体。Dicer 切割后形成siRNA,然后,在ATP的参与下,细胞中存在的一种RNA诱导的沉默复合体RNA-induced silencing complex RNAi干涉的关键步骤是组装RISC和合成介导特异性反应的siRNA蛋白。siRNA并入RISC中,然后与靶标基因编码区或UTR区*配对,降解靶标基因,因此说siRNA只降解与其序列互补配对的mRNA。其调控的机制是通过互补配对而沉默相应靶位基因的表达,所以是一种典型的负调控机制。siRNA识别靶序列是有高度特异性的,因为降解首先在相对于siRNA来说的中央位置发生,所以这些中央的碱基位点就显得极为重要,一旦发生错配就会严重抑制RNAi的效应。

siRNA的设计方法/siRNA 
关于设计siRNA以及siRNA设计对siRNA功能的影响,还没有可靠的规律。虽然可以通过对mRNA实验分析准确的找到一段基因的全部siRNA佳作用位置,但这个过程十分耗时且昂贵,不推荐常规实验使用。一种做法是每个目标序列设计3-4对siRNAs,实验选择较有效的siRNA。

siRNA设计大都根据Tuschl的实验,要点如下:

1.目标基因开放阅读框起始密码下游75至100碱基位置开始,寻找“AA”二连序列后的19个碱基序列。(用非“AA”的“XY”序列后的19个碱基序列同样可以得到很好效果的siRNA)。 设计siRNA时不要针对5’和3’端的非编码区。

2.分析获得的序列,选择GC比在40-55%之间的靶基因序列作为优选。

3.将潜在的序列和相应的基因组数据库(人,或者小鼠,大鼠等等)进行比较,排除和其他编码序列/EST同源的序列。例如使用BLAST等。

4.如果选择shRNA,有报道显示9个寡核苷酸的环是有效的。

下面是另一个设计的版本,大致相同:

1. 从转录本(mRNA)的AUG起始密码开始,寻找“AA”二连序列,并记下其3’端的19个碱基序列,作为潜在的siRNA靶位点。有研究结果显示GC含量在30%—50%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更为效。Tuschl等建议在设计siRNA时不要针对5’和3’端的非编码区(untranslated regions,UTRs),原因是这些地方有丰富的调控蛋白结合区域,而这些UTR结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响siRNP核酸内切酶复合物结合mRNA从而影响siRNA的效果。

2. 将潜在的序列和相应的基因组数据库(人,或者小鼠,大鼠等等)进行比较,排除那些和其他编码序列/EST同源的序列。例如使用BLAST

3. 选出合适的目标序列进行合成。通常一个基因需要设计多个靶序列的siRNA,以找到有效的siRNA序列。

一个完整的siRNA实验应该有负对照,作为负对照的siRNA应该和选中的siRNA序列有相同的组成,但是和mRNA没有明显的同源性。通常的做法是将选中的siRNA序列打乱,同样要检查结果以保证它和其他基因没有同源性。 如果计划合成siRNA,那么可以直接提供以AA打头的21个碱基序列,厂家会合成一对互补的序列。注意的是通常合成的siRNA是以3’dTdT结尾,如果要UU结尾的话通常要特别说明。有结果显示,UU结尾和dTdT结尾的siRNA在效果上没有区别。因为这个突出端无需和靶序列互补。

现在公司的网站上有完整的siRNA 的设计方法,可以自动设计并生成多个备选序列,并且可以自动连接到基因组数据库进行检索比对。

siRNA的制备/siRNA 
体外制备

1.化学合成

许多国外公司都可以根据用户要求提供高质量的化学合成siRNA。主要的缺点包括价格高,定制周期长,特别是有特殊需求的。由于价格比其他方法高,为一个基因合成3—4对siRNAs 的成本就更高了,比较常见的做法是用其他方法筛选出有效的序列再进行化学合成。

适用于:已经找到有效的siRNA的情况下,需要大量siRNA进行研究

不适用于:筛选siRNA等长时间的研究,主要原因是价格因素

2.体外转录

以DNA Oligo为模版,通过体外转录合成siRNAs,成本相对化学合成法而言比较低,而且能够比化学合成法更快的得到siRNAs。不足之处是实验的规模受到限制,虽然一次体外转录合成能提供足够做数百次转染的siRNAs,但是反应规模和量始终有一定的限制。而且和化学合成相比,还是需要占用研究人员相当的时间。值得一提的是体外转录得到的siRNAs毒性小,稳定性好,效率高,只需要化学合成的siRNA量的1/10就可以达到化学合成siRNA所能达到的效果,从而使转染效率更高。

适用于:筛选siRNAs,特别是需要制备多种siRNAs,化学合成的价格成为障碍时。

不适用于:实验需要大量的,一个特定的siRNA。研究。

3.用RNase III 消化长片断双链RNA制备siRNA

其他制备siRNA的方法的缺陷是需要设计和检验多个siRNA序列以便找到一个有效的siRNA。而用这种方法——制备一份混合有各种siRNAs “混合鸡尾酒” 就可以避免这个缺陷。选择通常是200—1000碱基的靶mRNA模版,用体外转录的方法制备长片断双链dsRNA ,然后用RNase III (or Dicer) 在体外消化,得到一种siRNAs“混合鸡尾酒”。在除掉没有被消化的dsRNA后,这个siRNA混合物就可以直接转染细胞,方法和单一的siRNA转染一样。由于siRNA混合物中有许多不同的siRNAs,通常能够保证目的基因被有效地抑制。

dsRNA消化法的主要优点在于可以跳过检测和筛选有效siRNA序列的步骤,为研究人员节省时间和金钱(注意:通常用RNAse III通常比用Dicer要便宜)。不过这种方法的缺点也很明显,就是有可能引发非特异的基因沉默,特别是同源或者是密切相关的基因。现在多数的研究显示这种情况通常不会造成影响。

适用于:快速而经济地研究某个基因功能缺失的表型

不适用于:长时间的研究项目,或者是需要一个特定的siRNA进行研究,特别是基因治疗

体内表达

前面的3种方法主要都是体外制备siRNAs,并且需要专门的RNA转染试剂将siRNAs转到细胞内。而采用siRNA表达载体和基于PCR的表达框架则属于:从转染到细胞的DNA模版中在体内转录得到siRNAs。这两种方法的优点在于不需要直接操作RNA。

4. siRNA表达载体

多数的siRNA表达载体依赖三种RNA聚合酶III 启动子(pol III)中的一种,操纵一段小的发夹RNA(short hairpin RNA, shRNA)在哺乳动物细胞中的表达。这三类启动子包括大家熟悉的人源和鼠源的U6启动子和人H1启动子。之所以采用RNA pol III启动子是由于它可以在哺乳动物细胞中表达更多的小分子RNA,而且它是通过添加一串(3到6个)U来终止转录的。要使用这类载体,需要订购2段编码短发夹RNA序列的DNA单链,退火,克隆到相应载体的pol III 启动子下游。由于涉及到克隆,这个过程需要几周甚至数月的时间,同时也需要经过测序以保证克隆的序列是正确的。

siRNA表达载体的优点在于可以进行较研究——带有抗生素标记的载体可以在细胞中持续抑制靶基因的表达,持续数星期甚至更久。

病毒载体也可用于siRNA表达,其优势在于可以直接高效率感染细胞进行基因沉默的研究,避免由于质粒转染效率低而带来的种种不便,而且转染效果更加稳定。

适用于:已知一个有效的siRNA序列,需要维持较长时间的基因沉默。

不适用于:筛选siRNA序列(其实主要是指需要多个克隆和测序等较为费时、繁琐的工作)。

5. siRNA表达框架

siRNA表达框架(siRNA expression cassettes,SECS)是一种由PCR得到的siRNA表达模版,包括一个RNA pol III启动子,一段发夹结构siRNA,一个RNA pol III终止位点,能够直接导入细胞进行表达而无需事前克隆到载体中。和siRNA表达载体不同的是,SECs不需要载体克隆、测序等颇为费时的步骤,可以直接由PCR得到,不用一天的时间。因此,SECs成为筛选siRNA的有效工具,甚至可以用来筛选在特定的研究体系中启动子和siRNA的适搭配。如果在PCR两端添加酶切位点,那么通过SECs筛选出的有效的siRNA后,可以直接克隆到载体中构建siRNA表达载体。构建好的载体可以用于稳定表达siRNA和长效抑制的研究。

这个方法的主要缺点是①PCR产物很难转染到细胞中(晶赛公司的Protocol可以解决这一问题)②不能进行序列测定,PCR和DNA合成时可能差生的误读不能被发现导致结果不理想。

适用于:筛选siRNA序列,在克隆到载体前筛选佳启动子

不适用于:抑制研究。(如果克隆到载体后就可以了)

主要应用/siRNA 
RNAi在基因沉默(silent gene)方面具有高效性和简单性,所以是基因功能研究的重要工具。

大多数药物属于标靶基因(或疾病基因)的抑制剂,因此RNAi 模拟了药物的作用,这功能丢失(LOF)的研究方法比传统的功能获得(GOF)方法更具优势。因此, RNAi 在今天的制药产业中是药物靶标确认的一个重要工具。同时,那些在靶标实验中证明有效的siRNA/shRNA本身还可以被进一步开发成为RNAi药物。

在药物标靶发现和确认方面,RNAi技术已获得了广泛的应用。生物技术公司或制药公司通常利用建立好的RNAi文库来引入细胞,然后通过观察细胞的表型变化来发现具有功能的基因。如可通过RNAi文库介导的肿瘤细胞生长来发现能抑制肿瘤的基因。一旦所发现的基因属于可用药的靶标(如表达的蛋白在细胞膜上或被分泌出细胞外),就可以针对此靶标进行大规模的药物筛选。此外,被发现的靶标还可用RNAi技术在细胞水平或动物体内进一步确认。

在疾病治疗方面,双链小分子RNA或siRNA已被用于临床测试用于几种疾病治疗,如老年视黄斑退化、肌肉性侧索硬化症、类风湿性关节炎、肥胖症等。在抗病毒治疗方面,帕金森病等神经系统疾病已经开始初步采用RNA干扰疗法。肿瘤治疗方面也已经取得了一些成果。

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