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RNA提取服务

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产品特点:
RNA提取服务细胞或组织中提取总RNA的试剂。在样品裂解或匀浆过程中,Trizol能保持RNA的完整性。加入仿后离心,样品分成水样层和有机层。RNA存在于水样层中。收集上面的水样层后,RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。在除去水样层后,样品中的DNA和蛋白也能相继以沉淀的形式还原。乙醇沉淀能析出中间层的DNA,在有机层中加入异丙醇能析出有机层的蛋白。共纯化DNA对于样品间标准化RNA的产量

原理:Trizol试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂。在样品裂解或匀浆过程中,Trizol能保持RNA的完整性。加入仿后离心,样品分成水样层和有机层。RNA存在于水样层中。收集上面的水样层后,RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。在除去水样层后,样品中的DNA和蛋白也能相继以沉淀的形式还原。乙醇沉淀能析出中间层的DNA,在有机层中加入异丙醇能析出有机层的蛋白。共纯化DNA对于样品间标准化RNA的产量十分有用。

Trizol试剂可用于小量样品(50~100mg组织,5×106细胞),也可用于大量样品(≥1g组织或≥107细胞),对人、动物、植物和细菌、血液提取都适用,可同时处理大量不同样品。一个小时内即可完成反应,提取的总RNA没有DNA和蛋白质污染,可用于Northern blot、RT-PCR、Dot blot、RNase保护分析等。

本试剂为红颜色,便于区分水相和有机相,同时大限度的保持RNA的完整性。

保存条件:2~8℃避光保存12个月。

工具/原料
Trizol,仿,异丙醇,75%乙醇(用RNase-Free水配制),RNase-Free水。
1ml注射器,1.5ml EP管(DEPC处理过),大、中、小号枪头(DEPC处理)
方法/步骤
1.样品处理:

(1)培养细胞:收获细胞1~5×107,加入1ml Trizol(异硫氰酸胍/酚)(在冰箱旁边取出白细胞即刻加入Trizol),混匀;用1ml注射器反复抽取(约30次)以破裂细胞及剪切DNA,室温静置5min(使核酸蛋白复合物*分离)。

(2)组织:取50~100mg组织(新鲜或-70℃及液氮中保存的组织均可)置1.5ml EP管中,加入1ml Trizol充分匀浆,室温静置5min。

2.可选步骤:如样品中含有较多蛋白质,脂肪,多糖或胞外物质(肌肉,植物结节部分等)可于2-8℃10000×g离心10分钟,取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜,多糖,高分子量DNA,上清中含有RNA。处理脂肪组织时,上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。

3.加入0.2ml仿,剧烈振荡15~30s,静置2~3min。

4.4℃离心,12000g×15min。样品分为三层:底层为黄色有机相,上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中,水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。

5.小心吸取上清至一新的DEPC处理过的1.5ml EP管中(如要分离DNA和蛋白质可保留有机相),加入0.5ml异丙醇,将管中液体轻轻混匀,-80℃静置20min。

6.4℃离心,12000g×10min。离心前看不出RNA沉淀,离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。

7.弃上清,于沉淀中加入75%乙醇(冰冷)1ml,振摇,充分洗涤沉淀。

8.4℃离心,12000g×5min。

9.弃上清,短暂离心,小心吸取弃去上清。

10.加入适量(20μl)DEPC (Rnase Free)H20溶解RNA(65℃促溶10~15min)。

11.取2μl进行电泳,其余-80℃保存。

END
注意事项
1.杜绝外源酶的污染。 (1)严格戴好口罩,手套。 (2)实验所涉及的离心管,Tip头,移液器杆,电泳槽,实验台面等要*处理。 (3)实验所涉及的试剂/溶液,尤其是水,必须确保RNase-Free。 2.阻止内源酶的活性。 (1)选择合适的匀浆方法。 (2)选择合适的裂解液。 (3)控制好样品的起始量。
3.明确自己的提取目的。 (1)任何裂解液系统在接近样品大起始量时,提取成功率急剧下降。 (2)RNA提取成功的一经济的标准是后续实验的一次成功,而不是得率。 Rnase污染的*来源 1.手指头 2.枪头 3.水/缓冲液 4.实验台面 5.内源Rnase 6.RNA样品 7.质粒提取 8.RNA保存 9.阳离子(Ca,Mg) 10.后续实验所用的酶

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