磷酸钙转染法的原理是通过DNA，氯化钙与磷酸缓冲液混合，沉淀形成包含DNA的极小不溶解的磷酸钙颗粒。这些磷酸钙颗粒会粘结到细胞膜上通过胞饮作用进入细胞中，从而达到外源质粒转染进入细胞的目的。磷酸钙转染法主要用于慢病毒包装。由于慢病毒包装需要的质粒量大，脂质体用量大，可能会影响细胞状态。而磷酸钙沉淀法因为试剂易取得、价格便宜而被广泛应用。
磷酸钙转染法实验过程
1. 转染前24小时选择状态良好的293T细胞传代， 4×10^6个细胞接种于10cm 细胞培养皿中。 2. 20-24h后，待细胞长至铺满细胞皿底约40-50%的时候，进行转染。 A：取1.5mlEP管，加入质粒： Lentivirus vector： 10ug VSVG 质粒 5ug REV 质粒 5ug 选择超纯水补至100ul。 向上述DNA溶液中加入50ul 2 M CaCl2 溶液，轻轻吹吸混匀。 B．向上述液体中逐滴加入2XHBS，立即吹打混匀在至呈现乳白色。或者选用电动移液枪，一边滴加，一边用电动移液枪进行吹打。不要超过一分钟。 C．将制备的混悬液室温放置10-15分钟。 D．将制备的混悬液轻轻地均匀滴入培养皿，轻轻摇匀后置于培养箱中，6-8h后换液。 因为在吹打混匀液体过程中，每个人的吹打力度不同，因此在制备混合液后可以取载玻片置于显微镜下，滴加一滴混合液，观察些颗粒大小。以便摸索实验的合适条件。 3、转染12至16小时之后给293T细胞换液。 4、转染48小时之后，如果质粒带有荧光标签，可以通过观察荧光判断转染效率。同时收集293T细胞的培养基, 3000rpm离心10分钟去除细胞碎片。
5、将离心后上清进行分装，如果一周内使用，可以临时放于4度冰箱。将其他分装的上清冻存于－80度冰箱中。因为病毒上清反复冻融，会造成病毒的滴度明显下降。
相关实验试剂配制 一.2XHBS（100ml）： NaCl: 1.636g,终浓度280mM KCl:0.074g, 终浓度10mM Na2HPO4: 0.0537g, 终浓度1.5 mM Glucose：0.2g, 终浓度12 mM HEPES：1.19g, 终浓度50 mM 调节pH范围在7.00- 7.45过滤分装后进行灭菌。 二.2M CaCl2(100ml)： 称取29.4g CaCl2-H2O，加入超纯水，过滤分装后进行灭菌。 |
