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细胞转染服务 实验耗材

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细胞转染服务今天我们来详述一下细胞转染的方法。细胞转染的方法主要包括:电穿孔法、磷酸钙沉淀法、脂质体转染法、病毒介导的转染等,理想的细胞转染方法是具有高转染效率、对细胞的毒性作用小等,本文主要介绍细胞转染常用的方法-脂质体转染的原理和操作步骤等。

磷酸钙转染法的原理是通过DNA,氯化钙与磷酸缓冲液混合,沉淀形成包含DNA的极小不溶解的磷酸钙颗粒。这些磷酸钙颗粒会粘结到细胞膜上通过胞饮作用进入细胞中,从而达到外源质粒转染进入细胞的目的。磷酸钙转染法主要用于慢病毒包装。由于慢病毒包装需要的质粒量大,脂质体用量大,可能会影响细胞状态。而磷酸钙沉淀法因为试剂易取得、价格便宜而被广泛应用。


磷酸钙转染法实验过程

1. 转染前24小时选择状态良好的293T细胞传代, 4×10^6个细胞接种于10cm 细胞培养皿中。

2. 20-24h后,待细胞长至铺满细胞皿底约40-50%的时候,进行转染。

A:取1.5mlEP管,加入质粒:

Lentivirus vector: 10ug

VSVG 质粒 5ug

REV 质粒 5ug

选择超纯水补至100ul。

向上述DNA溶液中加入50ul 2 M CaCl2 溶液,轻轻吹吸混匀。

B.向上述液体中逐滴加入2XHBS,立即吹打混匀在至呈现乳白色。或者选用电动移液枪,一边滴加,一边用电动移液枪进行吹打。不要超过一分钟。

C.将制备的混悬液室温放置10-15分钟。

D.将制备的混悬液轻轻地均匀滴入培养皿,轻轻摇匀后置于培养箱中,6-8h后换液。

因为在吹打混匀液体过程中,每个人的吹打力度不同,因此在制备混合液后可以取载玻片置于显微镜下,滴加一滴混合液,观察些颗粒大小。以便摸索实验的合适条件。

3、转染12至16小时之后给293T细胞换液。

4、转染48小时之后,如果质粒带有荧光标签,可以通过观察荧光判断转染效率。同时收集293T细胞的培养基, 3000rpm离心10分钟去除细胞碎片。


5、将离心后上清进行分装,如果一周内使用,可以临时放于4度冰箱。将其他分装的上清冻存于-80度冰箱中。因为病毒上清反复冻融,会造成病毒的滴度明显下降。

相关实验试剂配制

一.2XHBS(100ml):

NaCl: 1.636g,终浓度280mM

KCl:0.074g, 终浓度10mM

Na2HPO4: 0.0537g, 终浓度1.5 mM

Glucose:0.2g, 终浓度12 mM

HEPES:1.19g, 终浓度50 mM

调节pH范围在7.00- 7.45过滤分装后进行灭菌。

二.2M CaCl2(100ml):

称取29.4g CaCl2-H2O,加入超纯水,过滤分装后进行灭菌。

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