Ficoll是蔗糖的多聚体,呈中性,平均分子量为400,000,当密度为1.2g/ml仍未超出正常生理性渗透压,也不穿过生物膜。红细胞、粒细胞比重大,离心后沉于管底;淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重,离心后漂浮于分层液的液面上,也可有少部分细胞悬浮在分层液中。吸取分层液液面的细胞,就可从外周血中分离到单个核细胞。 工具/原料 全血 (以10ml为例) 无菌PBS溶液(pH7.4) 或者生理盐水 蔗糖溶液(Ficoll Pague PLUS) (GE Healthcare Life Sciences #17-1440-02) RPMI 1640培养基 (Invitrogen) 胎牛血清(FBS)(GIBCO) 双抗P/S (Penicillin/ Streptomycin) (GIBCO) 二甲亚砜(DMSO)(SIGMA) 预先装好异丙醇的冻存盒 方法/步骤 配制所需的溶液: a. 细胞培养基:RPMI 1640+10% FBS+1% P/S; b. 细胞冻存液:FBS中加入10%DMSO; 将10ml全血转入50ml离心管中,加入10ml PBS溶液稀释,轻轻混匀; 取两支15ml离心管,先加入5ml Ficoll溶液。然后将稀释的血液轻轻加到两支离心管的ficoll上层,一定要轻柔,避免两种溶液混合在一起,每只离心管各10ml稀释血液; 2,000rpm,20min,注意,降速设置中一定要设置成no break,或者只有1-2成的制动。离心完毕将得到如图所示分层; 人外周血单核细胞(PBMC)分离及培养 PBMC所在细胞层为白色。此时可以用吸管将该层细胞吸取在另一干净的15ml离心管中。 加入PBS至10-15ml,1,500rpm,10min离心后去掉上清,再加入培养基进行相同操作的清洗; 7 加入5-10ml培养基重悬细胞,进行后续计数培养或者铺板; 8 细胞冻存:将细胞离心收集之后,用细胞冻存液重悬。取1-1.5ml细胞至冻存管中,放入冻存盒(冻存盒可事先在4℃冰箱预冷)。再将冻存盒放置于-80℃冰箱过夜。第二天将细胞转入液氮中保存。 END 注意事项 全血溶液可以加在Ficoll上层或者下层,但是终都必须保证两种溶液分层清晰。 分离PBMC*步离心的时候,一定不能设置或设置低水平的制动。否则将分层混乱。 |