人或动物体内（或胚胎）的组织，将其剪碎至1mm3的组织块，再采用如下方法进行原代细胞分离培养：  一、悬浮细胞的分离方法
1、将血液、羊水、胸水或腹水等悬液直接转至离心管中，1000rpm/分钟离心5分钟。 2、去掉上清，离心沉淀用无钙、镁的PBS清洗后1000rpm/分钟离心5分钟。此步重复两次。 3、用培养基重悬，调整适当细胞浓度后分瓶培养。 4、如选用悬液中某种细胞，可采用离心后的细胞分层液收获目的细胞。
二、实体组织材料的分离方法
（一）机械分散法 1、纤维成分很少的脑组织，部分胚胎组织，用剪刀剪碎至1mm3的组织块。 2、用PBS清洗两次后 ①用吸管吹打，分散组织细胞。 ②或将已充分剪碎分散的组织放在注射器内（用九号针），使细胞通过针头压出。 ③或在不锈钢纱网内用钝物（注射器钝端）压挤使细胞从网孔中压挤出。 3、收集细胞转入离心管中，1000rpm/分钟离心5分钟。 4、去上清，加入含血清的培养基，重悬后移至培养瓶中培养。
（二）消化分离法
1、酶消化分离法（过夜冷消化法） ①细胞间质较少的软组织，如肝、肾、甲状腺、羊膜、胚胎组织、上皮组织等，用Hanks液清洗组织三次，剪成碎块大小为4毫米左右。 ②再用Hanks液洗2-3次以除去血球和脂肪组织。 ③加入0.25%的胰蛋白酶，摇匀后放4℃过夜。 ④次日再用Hanks液洗涤，弃去上清，共洗2-3次。 ⑤加入少量含血清的培养基吹打分散，细胞计数，按适当的浓度分瓶培养。 2、非酶消化法（EDTA消化法） ①把组织块剪碎，呈1mm3大小的组织块。 ②将碎组织块在平皿中用无钙镁PBS洗2-3次。 ③加入消化液（胰蛋白酶或胶原酶或EDTA）于37℃水浴中作用适当时间（中间可轻摇1~2次），若组织块膨松呈絮状可终止，若变化不大可更换一次消化液，继续消化直至膨松絮状为止。 ④弃去上清，加入含有钙、镁离子的培养基中止消化反应，并洗涤2-3次后，加入*培养基。 ⑤用吸管吹打，使细胞充分散开后用纱网过滤后分瓶培养。
（三）原代细胞培养 原代培养是直接从生物体获取细胞进行培养。由于细胞刚刚从活体组织分离出来，故更接近于生物体内的生活状态。这一方法可为研究生物体细胞的生长、代谢、繁殖提供有力的手段，同时也为以后传代培养创造条件。利用此方法还可直接服务于临床实践。例如，用从手术中切除的肿瘤细胞进行原代培养，然后用该培养细胞进行抗癌药物的筛选，根据肿瘤细胞对加入的化疗药物的敏感性来帮助选择有效的化疗方案，有可能起到增强疗效、降低副作用的作用。
（四）原代细胞的传代、保存
（1）传代：依椐细胞的生长状态，生长的细胞1：2或1：3进行传代。 （2）保存：DMSO＋培养液＋血清 按下列顺序降温：室温→4℃（20分钟）→冰箱冷冻室（30分钟）→超低温冰箱（－80℃ 过夜）→液氮。
（五）原代细胞的复苏
（1）取出细胞，迅速放入37℃温水中快速解冻。 （2）吸出细胞悬液，并加10倍以上培养液。 （3）用培养液适当稀释后接种培养瓶，放入37℃ CO2 培养箱静置培养。 |
