平板克隆形成实验基本步骤： 1、取对数生的各组细胞，分别用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，并把细胞悬浮在10%胎牛血清的DMEM培养液中备用。
2、将细胞悬液作梯度倍数稀释，每组细胞分别以每皿50、100、200个细胞的梯度密度分别接种含10mL 37℃预温培养液的皿中，并轻轻转动，使细胞分散均匀。置37℃ 5% CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养2～3周。 3、经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去上清液，用PBS小心浸洗2次。加4%多聚甲醛固定细胞5mL固定15分钟。然后去固定液，加适量GIMSA应用染色液染10～30分钟，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。 4、将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，或在显微镜（低倍镜）计数大于10个细胞的克隆数。后计算克隆形成率。 克隆形成率 =（克隆数/接种细胞数）×100% 平板克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。细胞一定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过大。 平板克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。细胞一定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过大。 软琼脂培养克隆形成试验基本步骤：
(1)取对数生细胞，用0.25%胰蛋白酶消化并轻轻吹打，使之成为单细胞，作活细胞计数，用含20%胎牛血清的DMEM培养液调整细胞密度至1×106细胞/L。然后根据实验要求作梯度倍数稀释。 (2)用蒸馏水分别制备出1.2%和0.7%两个浓度的低溶点琼脂糖液，高压灭菌后，维持在40℃中不会凝固。 (3)按1:1比例使1.2%的琼脂糖和2×DMEM培养基(含有2×抗生素和20%的小牛血清)混合后，取3mL混合液注入直径6cm平皿中(10cm平皿加7～10mL)，冷却凝固，可作底层琼脂置CO2温箱中备用。 (4)按1:1比例让0.7%的琼脂糖和2×DMEM培养基在无菌试管中相混以后，再向管中加入0.2mL的细胞悬液，充分混匀，注入铺有1.2%琼脂糖底层平皿中，逐形成双琼脂层。待上层琼脂凝固后，置入37℃ 5%CO2温箱中培养10～14天。 (5)把平皿放置在倒置显微镜下，观察细胞克隆数。计算形成率。 软琼脂培养法常用检测肿瘤细胞和转化细胞系。试验中琼脂与细胞相混时，琼脂温度不宜超过40℃。接种细胞的密度每平方厘米不超过35个，一般6cm的平皿接种1000个细胞。正常细胞在悬浮状态下不能增殖，不适用于软琼脂克隆形成试验。 软琼脂集落形成率实验(软琼脂克隆) 将1.2％低熔点琼脂糖与2×细胞培养基以1:1 的体积比混合制备0.6％的底层琼脂，6 孔板中每个孔1.4ml 温室凝固，取对数期细胞，胰酶消化后吹散成单个细胞悬液，计数，并调细胞浓度为10000 个/ml，将0.6％低熔点琼脂糖与2×细胞培养基以1:1 的体积比混合，制备0.3％的上层琼脂，每孔加1ml 上层琼脂和100ul 单细胞悬液（约1000cell/well)，混匀，室温凝固。置于37℃，5％CO2 的细胞培养箱中培养2－3 周，计数含50 个细胞以上得克隆，计算细胞集落形成率，SpotII 采集图像。 |
