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血液淋巴细胞分离服务 实验耗材

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产品特点:
血液淋巴细胞分离服务的聚蔗糖2份和34%的泛影葡胺1份混合制成。它具有分子量大、无化学活性、20℃时比重为1.077士0.001的特性。血液中各种细胞的比重不同,淋巴细胞与单核细胞的比重约为1.070,而粒细胞和红细胞的比重为1.092左右。将血液加至分离液上,通过离心,可使一定比重的细胞按相应密度梯度进行分布,从而将淋巴细胞与其它血细胞分离开。

材料

  1. 淋巴细胞分离液 (比重1.077土0.001)。

  2. 肝素。

  3. 无Ca2+、Mg2+的Hanks溶液,pH7.2~7.6。

  4. RPMI-1640培养液(含10%小牛血清)。

  5. 其它:注射器、吸管、滴管(均为无菌),血球计数板,水平离心机,显微镜等。

  方法

  1. 无菌抽取静脉血2ml,去掉针头注人含有肝素的无菌试管中摇匀,加入2ml Hanks溶液进行对倍稀释,混匀。

  2. 用吸管吸取稀释血液沿试管壁缓缓加到含有2ml淋巴细胞分离液的试管中(血液:Hanks液:淋巴细胞分离液的比例为1:1:1),沿管壁流下的稀释血液叠加在分离液之上,并与分离液形成明显的界面。

  3. 经水平式离心2000r/min×20min,小心取出试管。

  4. 用平口吸管小心吸取中层呈白色雾状的淋巴细胞层,用Hanks溶液洗涤两次,每次离心1500r/min×10min。

  5. 弃上清,加RPMI-1640培养液1ml混匀,取少许进行细胞计数及活力测定。

  (1) 细胞计数: 取1滴细胞悬液置血球计数板上,静置片刻,显微镜下计数四角四个大方格内的细胞数(见图15),按下列公式计算出细胞总数。

  四个大方格细胞总数 ×稀释倍数×细胞悬液毫升数×104

  细胞总数 = 4

  (2)台盼蓝拒染法测定细胞活力: 取4份0.2%台盼蓝与1份4.25%生理盐水混合,将台盼蓝生理盐水溶液与细胞悬液等量混合,在3分钟之内压片,在光学显微镜下计数未染色的细胞(为活细胞)与染色细胞(染成兰色,为死细胞),计算活细胞占细胞总数的百分数。

  活细胞数 ×100%。

  细胞存活率= 活细胞数+死细胞数

  6. 后将淋巴细胞悬液用RPMI-1640培养液配成相应的细胞浓度备用。

  结果

  在回收细胞分离液上界面的总细胞中单个核细胞应占90%以上(同时细胞存活率应大于90%),其中的粒细胞占0-5%,血小板小于0.5%,红细胞占0-7%。

  注意事项

  1.抽血后在2小时内使用。

  2.注意将稀释后的血轻轻地沿管壁铺在聚蔗糖液面上,避免破坏其界面。

3. 在收集单个核细胞时,将吸管轻轻插入单个核细胞层,沿管壁轻轻旋转吸取细胞。

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