材料
1. 淋巴细胞分离液 (比重1.077土0.001)。
2. 肝素。
3. 无Ca2+、Mg2+的Hanks溶液，pH7.2～7.6。
4. RPMI-1640培养液(含10%小牛血清)。
5. 其它:注射器、吸管、滴管（均为无菌）,血球计数板，水平离心机，显微镜等。
方法
1. 无菌抽取静脉血2ml，去掉针头注人含有肝素的无菌试管中摇匀，加入2ml Hanks溶液进行对倍稀释，混匀。
2. 用吸管吸取稀释血液沿试管壁缓缓加到含有2ml淋巴细胞分离液的试管中（血液:Hanks液:淋巴细胞分离液的比例为1:1:1），沿管壁流下的稀释血液叠加在分离液之上，并与分离液形成明显的界面。
3. 经水平式离心2000r/min×20min，小心取出试管。
4. 用平口吸管小心吸取中层呈白色雾状的淋巴细胞层，用Hanks溶液洗涤两次，每次离心1500r/min×10min。
5. 弃上清，加RPMI-1640培养液1ml混匀，取少许进行细胞计数及活力测定。
（1） 细胞计数: 取1滴细胞悬液置血球计数板上，静置片刻，显微镜下计数四角四个大方格内的细胞数（见图15），按下列公式计算出细胞总数。
四个大方格细胞总数 ×稀释倍数×细胞悬液毫升数×104
细胞总数 = 4
（2）台盼蓝拒染法测定细胞活力: 取4份0.2%台盼蓝与1份4.25%生理盐水混合，将台盼蓝生理盐水溶液与细胞悬液等量混合，在3分钟之内压片，在光学显微镜下计数未染色的细胞（为活细胞）与染色细胞（染成兰色,为死细胞），计算活细胞占细胞总数的百分数。
活细胞数 ×100%。
细胞存活率＝ 活细胞数+死细胞数
6. 后将淋巴细胞悬液用RPMI-1640培养液配成相应的细胞浓度备用。
结果
在回收细胞分离液上界面的总细胞中单个核细胞应占90%以上（同时细胞存活率应大于90%），其中的粒细胞占0-5%，血小板小于0.5%，红细胞占0-7%。
注意事项
1.抽血后在2小时内使用。
2.注意将稀释后的血轻轻地沿管壁铺在聚蔗糖液面上，避免破坏其界面。
3. 在收集单个核细胞时，将吸管轻轻插入单个核细胞层，沿管壁轻轻旋转吸取细胞。 |
