织切片上变性神经元的胞体、树突和轴突,而且能显示脑内 神经细胞凋亡和组织中淀粉样蛋白沉积。FJ染色除了能浸 染溃变神经元外,还可以用于退变有髓纤维束的追踪,如视 神经束等。目前用于退变神经元染色的FJ染料主要有FJ、FJB和FJC三种。与FJ和FJB染料相比[12],FJC染料效果更优,亲和力更高,染色时间短,所需浓度低。此外,其还可 与其它荧光素标记物结合进行多重荧光染色。Chidlow 等[13]采用FJC和DAPI(一种能够与DNA强力结合的荧光 染料)荧光双染技术评价大鼠视网膜和视神经纤维损伤后 神经元退变情况。Mechírová等[14]探讨脊髓缺血/再灌注后 神经元退变,试验前预先施用去甲肾上腺素和银杏叶乙醇提 取物EGb761的家兔,FJB染色结果发现缺血/再灌注后大鼠 脊髓侧角Ⅶ,Ⅷ,Ⅸ对阳性神经元明显下降。 3 神经胶质细胞染色(Glial staining) 3.1 星形胶质细胞 Cajal法染色是一种选择性浸染星形 胶质细胞的染色技术。原理是切片经氯化金汞溶液浸染, 然后通过亚硫酸钠溶液使星形胶质细胞着色稳定。缺点是 染液需临用前配制,不易保存,染色耗时长,染色结果不稳 定。Kitch等[15]建立的星形胶质细胞染色方法,能选择性地 浸染原生质型或纤维型星形胶质细胞的胞体,而对其他胶质 细胞的浸染具有抑制作用。但对于Ⅱ型阿尔采末病引起的 星形胶质细胞病变状态难以浸染。杨壮来在Cajal法染色的 基础上对组织的切片,固定,浸染等步骤进行了修改。改良 后的方法使纤维型星形胶质细胞染色均匀,背景浅,染色时 间明显缩短。许多神经退行性疾病,如帕金森病、阿尔采末 病,常与脑内神经细胞,尤其是星形胶质细胞的损伤(或退 化),脑中神经纤维丛的出现以及类淀粉斑有关。邓广斐等 采用将神经毒素MPTP注入C57BL/6小鼠腹腔建立帕金森 病动物模型。经碳酸银染色发现,帕金森病模型组星形胶质 细胞增生与激活明显。 3.2 小胶质细胞 1963年Naoumenko等报道采用碳酸银 法浸染小胶质细胞,再经过甲醛溶液还原使银沉积在组织切 片上。与常规HE染色相比,碳酸银染色能够显现出胞体及 其突起。但碳酸银见光易分解,不易保存。但后来Gallyas 报道的银染法具有组织可于甲醛溶液中保存数年,适用于多 种标本的取材,包括冰冻切片、石蜡切片等,可批量进行染色 操作,浸染过程可在镜下操作便于控制染色时间等优点。郑 翔等将组织标本由原来的火棉胶处理改为石蜡处理。虽然 准确稳定的浸染出小胶质细胞,但仍存在一些缺陷,如切片 厚度不能太厚,背景过深等。于腾波等探讨活化的小胶质细 胞移植治疗大鼠脊髓中度损伤的疗效。碳酸银染色和BBB 评分结果显示:移植组比同期对照组阳性细胞数明显增多, 移植组术后后肢运动功能评分较对照组明显升高。 3.3 少突胶质细胞 少突胶质细胞染色原理与其他镀银染 色技术相类似,主要依据神经细胞嗜银性。1930年Penfield 采用Del Rio⁃Hortega’s改良法成功浸染出少突胶质细胞。 该法对脊髓,脑干及颅脑白质区域的少突胶质细胞浸染可靠 性好,并且还可选择性浸染外周神经施万细胞的髓鞘,但染 色背景较粗糙,影响观察。1948年Grino等将钨酸钠添加至硝酸银溶液中,使少突胶质细胞的呈现更为清楚。少突胶质 细胞对氧具有特殊的亲和力,经过过氧化氢溶液处理后,激 活了少突胶质细胞内的碳!基而发生显色反应。但此法对 于细胞突起的显示不够清晰,操作比较繁琐。姚竹秀将Gri⁃no法进行改进,采用Peufield染色法所用的固定剂固定组织,得到较好的染色结果,并认为固定剂成分和酸碱度对染 色的成败大有关系。马廷贤将银溶液中的碳酸钠浓度调至 饱和,用DAB和H2O2对切片进行预处理,同时把浸染的时间延长和温度升高,染色结果稳定性和成功率大为提高。细胞形态显现的原因可能是DAB对银离子具有吸附作用,使其在胶质细胞的胞体和突起上沉积而显色。 4 髓鞘染色(myelin staining) 髓鞘是包裹在神经细胞轴突外面的一层膜。神经纤维 受损时,如多发性硬化症,脑脊髓炎等疾病均可导致髓鞘的 变形,崩解或脱失。目前常用髓鞘染色方法有媒染法,利用 锇酸与类脂质的特殊反应和油溶性染料浸染法3种。媒染 法主要是因为经铬盐或铁矾媒染的磷脂(髓鞘主要成分)易 与苏木素结合而着色,具有操作简单,试剂便宜的优点。但 染色结果对比度差、且分化不易掌控,较难被初学者所掌握。 锇酸与类脂质的特殊反应主要原理是:将类脂质组织(磷 脂)固定于锇酸溶液后,能被氧化成黑色体,由此特异性鉴别 髓鞘。经锇酸固定后的类脂质组织不会被脂溶性溶剂溶解, 提高了结果准确性。但锇酸价格昂贵,且不易久存;其次因 浸透性差,经常造成组织背景模糊,不易观察。油溶性染料 主要是指Luxol固蓝,是Kluver等[16]于1953年将其应用于 髓鞘染色。Luxol固蓝在乙醇溶液内具有与髓鞘磷脂结合染 色的特性,如再经过中性红或焦油紫复染,不仅对髓鞘着色 有一定的强化效应,而且还可浸染神经元的胞核及尼氏体。Luxol固蓝染色能够浸染髓鞘束和单一髓鞘纤维,髓鞘着色鲜明,背景清晰。吕广明认为该法对于鉴定神经髓鞘的特异性具有良好的标记作用,常用于显示髓鞘含量丰富的神经传导束,如皮质脊髓束。此外,也可用来分析髓鞘再生及脱髓鞘的程度[17]。与媒染法、锇酸染色法相比,对比度明显提高,特异性好,但试剂较贵,不易购买。在研究神经退行性疾病中,髓鞘染色通常与尼氏染色相结合,使结果对比鲜明。Chen等[18]探讨3,4二羟苯基乳酸(DLA)对脊髓压迫损伤后的炎症影响。Luxol固蓝和Nissl染色结果显示,经DLA 施用后的大鼠,伤后d10髓鞘退变缓慢。朱桂彬等利用改良的Marsland银染法与Luxol固蓝双重染色观察人老年痴呆症尸检脑组织。结果发现脑组织中老年斑呈均质的嗜银团,神经元纤维增粗,扭曲形成缠结清晰可见,且染色背景清晰,几无银颗粒沉淀。 5 突触染色(synapse staining) 目前有两种显示神经突触的方法。镀银染色法通常采 用Cajal染色法和Golgi染色法来显示突触,其主要根据突触 的嗜银性而使突触着色[19]。但由于过程繁琐,染色结果不 稳定而未被广泛使用。Singh[20]通过改良镀银染色发现,大 鼠伤后d7即可在神经纤维网齿状回观察到少量退变突触。 杨壮来将Cajal法进行改良并成功显示神经突触。改良后的 |
