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Von kossa染色服务

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产品特点:
Von kossa染色服务ALP在pH值9.4的环境下,以镁离子作为激活剂,能够把β-*水解出磷酸,磷酸与高浓度的钙盐结合形成无色的磷酸钙,再与硝酸钴作用形成磷酸钴,经硫化胺处理形成黑色的硫化钴沉淀在酶活性处。

碱性磷酸酶(ALP)是成熟成骨细胞的标志性酶之一。1 Gomori钙钴法
【染色原理】 ALP在pH值9.4的环境下,以镁离子作为激活剂,能够把β-*水解出磷酸,磷酸与高浓度的钙盐结合形成无色的磷酸钙,再与硝酸钴作用形成磷酸钴,经硫化胺处理形成黑色的硫化钴沉淀在酶活性处。
【孵育液配制】3%β-* 5ml
2%*钠 5ml
蒸馏水 10ml
2% CaCl2 10ml
2% MgSO4 1ml
【步骤】
(1)将无菌的玻片放入培养皿中,传代时加入适量的细胞悬液,作细胞爬片,呆细胞长满玻片后取出。
(2)PBS冲洗后用冷丙醇固定10min,蒸馏水冲洗数次。
(3)入孵育液中,37℃孵育4-6h。自来水冲洗数次。
(4)2%硝酸钴中浸3-5min,蒸馏水洗数次。
(5)1%的硫化铵中2min,自来水冲洗,自然干燥,封固。
【结果】胞质中阳性反应呈现灰黑色颗粒或块状沉淀。
2 偶氮偶联法:
【孵育液配制】 萘酚AS-BI磷酸盐 20mg
DMSO 0.5ml
0.2mol/L*醋酸缓冲液(PH 9.2) 50ml
六偶氮副品红 0.5ml
1mol/L NaOH调PH 9-10,混合后过滤使用。
(六偶氮副品红:副品红400mg,浓盐酸2ml,双蒸水8ml混合过滤;临用前与等体积4%*混合)
【步骤】
(1)细胞爬片成功后,PBS冲洗后,置入4℃ 10%甲醛固定10min。
(2)蒸馏水冲洗。
(3)将过滤孵液直接滴加于玻片上,室温下作用45min。
(4)流水冲洗,晾干。
(5)甘油明胶封固。
【结果】成骨细胞胞质中可见红色ALP阳性颗粒。
3 碱性磷酸酶染色试剂盒法:
【作用原理】 细胞内碱性磷酸酶在Ph9.4-9.6条件下水解磷酸萘酚AS-MX产生萘酚,后者被重氮盐捕获,生成不溶性有色沉淀。
【作用液配制】取2号储备液10ml,加3号液200ul,再加4号粉剂10mg,振摇速溶,立即过滤到细胞爬片上。
【步骤】
(1)细胞爬片滴加数滴1号液,室温固定一分钟(不可以延长),流水漂洗2分,晾干。
(2)滴加作用液数滴,置湿盒内于37℃孵育2小时,流水冲洗2分钟。
(3)滴加5号液数滴,复染5分钟,流水冲洗2分钟,晾干。
【结果】阳性结果是胞浆内出现蓝色沉淀。
1 茜素红法
【步骤】
(1)培养皿用PBS冲洗2次,95%乙醇固定10min,双蒸水冲洗3次。
(2)0.1%茜素红-Tris-Hcl(PH 8.3)37℃,30min。
(3)蒸馏水冲洗,干燥,封片。
【结果】染料品种的不同,矿化结节呈现不同的红色。
2 von Kossa法
【步骤】
(1)培养皿用PBS冲洗2次,4%多聚甲醛固定5分钟,双蒸水冲洗3次。
(2)培养皿中加入5%*溶液1ml,将培养板开盖在紫外灯下照射1小时。
(3)倒出残留的*溶液,蒸馏水冲洗3遍。
(4)培养皿中加入5%*溶液1ml,中和残留的*溶液,吸出残液。
(5)室温下晾干,封固。

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