原理 细胞在发生凋亡时，会激活一些DNA内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA。细胞凋亡时抽提DNA进行电泳检测，可以发现180-200bp的DNA ladder。基因组DNA断裂时，暴露的3’-OH可以在末端脱氧核苷酸转移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT) 的催化下加上荧光素 (FITC) 标记的dUTP (fluorescein-dUTP) ，从而可以通过荧光显微镜或流式细胞仪进行检测，这就是TUNEL (TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling) 法检测细胞凋亡的原理。 实验方法 对于贴壁细胞或细胞涂片 a. PBS或HBSS洗涤一次。 b. 如果细胞贴得不牢，可以干燥样品使细胞贴得更牢。 c. 用4%多聚甲醛或碧云天生产的免疫染色固定液(P0098)固定细胞30-60分钟。 d. 用PBS或HBSS洗涤一次。 e. 加入含0.1% Triton X-100的PBS，冰浴孵育2分钟。 f. 转步骤5。 对于悬浮细胞或细胞悬液 a. 收集细胞(不超过200万细胞)，PBS或HBSS洗涤一次。 b. 用4%多聚甲醛固定细胞30-60分钟。为防止细胞聚集成团，宜在侧摆摇床或水 平摇床上缓慢摇动的同时进行固定。 c. 用PBS或HBSS洗涤一次。 d. 用含0.1% Triton X-100的PBS重悬细胞，冰浴孵育2分钟。 e. 转步骤5。 对于石蜡切片 a. 二甲苯中脱蜡5-10分钟。换用新鲜的二甲苯，再脱蜡5-10分钟。无水乙醇5分钟。90%乙醇2分钟。70%乙醇2分钟，蒸馏水2分钟。 b.滴加20μg/ml不含DNase的蛋白酶K，20-37℃作用15-30分钟(不同组织的作用温度和时间需自行摸索)。 c. PBS或HBSS洗涤3次。注意：这一步必须把蛋白酶K洗涤干净，否则会严重干扰后续的标记反应。 d. 转步骤5。 对于冷冻切片 a. 用4%多聚甲醛固定细胞30-60分钟。 b. PBS或HBSS洗涤2次，每次10分钟。 c. 加入含0.1% Triton X-100的PBS，冰浴孵育2分钟。 d. 转步骤5。 对于贴壁细胞、细胞涂片或组织切片 a. 用PBS或HBSS洗涤2次。 b. 在样品上加50μl TUNEL检测液，37℃避光孵育60分钟。注意：孵育时需注意在周围用浸足水的纸或药棉等保持湿润，以尽量减少TUNEL检测液的蒸发。 c. PBS或HBSS洗涤3次。 d. 用抗荧光淬灭封片液封片后荧光显微镜下观察。可以使用的激发波长范围为450-500nm，发射波长范围为515-565nm(绿色荧光)。 对于悬浮细胞或细胞悬液 a. 用PBS或HBSS洗涤2次。 b. 加入50μl TUNEL检测液，37℃避光孵育60分钟。 c. PBS或HBSS洗涤2次。 d. 用250-500μl PBS或HBSS悬浮。 e. 此时可以用流式细胞仪进行检测或涂片后在荧光显微镜下观察。可以使用的激发波长范围为450-500nm，发射波长范 围为515-565nm(绿色荧光)。 常见问题 出现非特异性荧光标记 a. 有些细胞或组织，例如平滑肌细胞或组织，nuclease或polymerase的酶活性水平较高，易导致出现非特异性的荧光标记。解决方法是，取细胞或组织后立即固定并且要充分固定，以阻止这些酶导致假阳性。 b. 使用了不适当的固定液，例如一些酸性固定液，导致出现假阳性。建议采用推荐的固定液。 c. TUNEL检测反应时间过长，或TUNEL检测反应过程中反应液渗漏，细胞或组织表面不能保持湿润，也可能出现非特异性荧光。注意控制反应时间，并确保TUNEL检测反应液能很好地覆盖样品。 荧光背景很高 a. 支原体污染。请使用支原体染色检测试剂盒检测是否为支原体污染。 b. 高速分裂和增殖的细胞，有时也会出现细胞核中的DNA断裂。 c. TUNEL反应过强。可以用试剂盒提供的TdT酶稀释液稀释TdT酶2-5倍后再按照说明书操作。稀释后的TdT酶需当日使用。 d. 红细胞中血红蛋白导致的自发荧光产生严重干扰。此时宜选择其它细胞凋亡检测试剂盒。 标记效率低 a. 使用乙醇或甲醇固定会导致标记的效率较低。 b. 固定时间过长，导致交联程度过高。此时宜减少固定时间。 c. 荧光淬灭。Fluorescence在普通光照10分钟就会严重淬灭。解决方法是需注意避光操作。 d. 碘化丙啶双染时，如果碘化丙啶染色过深会导致观察到的本试剂盒的TUNEL染色效果减弱。碘化丙啶可以接受fluorescein激发产生的荧光，从而起到淬灭作用。解决方法是用较低浓度的碘化丙啶染色，例如0.5μg/ml碘化丙啶。
