服务项目：细胞爬片免疫组化服务 服务简介：细胞爬片免疫组化服务 1、载玻片的处理： 抗原修复过程中，由于高温、高压、辐射等诸多因素的影响，极易造成脱片。为保证试验的正常 进行，可选用我公司提供的 ZLI-9001 APES、ZLI-9003 HistogripTM 或 ZLI-9005 Poly-L-Lysine 等几种 试剂，对已清洗的载玻片进行处理。具体方法如下： 1.1 APES：现用现配。将洗净的玻片放入以 1:50 比例丙酮稀释的 APES 中，停留 20~30 秒钟，取出 稍停片刻，再入纯丙酮溶液或蒸馏水中涮去未结合的 APES，置通风橱中晾干即可。用此载玻片捞片 时应注意组织要一步到位，并尽量减少气泡的存在，以免影响染色结果。 1.2 HistogripTM：将洗净的玻片放入以 1:50 比例丙酮稀释的 Histogrip 液中，停留 1~2 分钟，然后用双 蒸水快速清洗三次，室温干燥或 60oC 烤箱烘烤一小时，装盒备用。 1.3 Poly-L-Lysine：将洗净、干燥的载玻片放入以 1:10 比例去离子水稀释的多聚赖氨酸溶液中，浸泡 5 分钟，60oC 烤箱烘烤一小时或室温过夜干燥。装盒备用。试验中使用的器具均为非玻璃制品。 2、常用酶消化： 2.1 胰蛋白酶：一般使用浓度为 0.05%~0.1%，消化时间为 37℃、10~40 分钟，主要用于细胞内抗原的 显示。 2.2 胃蛋白酶：一般使用浓度为 0.4%，消化时间为 37℃、30~180 分钟，主要用于细胞间质抗原的显示， 如：Laminin（层粘蛋白），Collagen IV（IV 型胶原）等。 2.3 皂素（Saponin）：一般使用浓度为 2~10m g/ml 的 saponin 溶液，消化时间为室温孵育 30 分钟。 3、抗原热修复： 可根据实验室的具体条件，选用微波炉抗原修复、高压锅抗原修复或水浴高温抗原修复。抗原热 修复可选用各种缓冲液，如 TBS、PBS、重金属盐溶液等，但实验证明，以 0.01M枸橼酸盐缓冲液（pH6.0） 效果。请选用我公司提供的 ZLI-9064 枸橼酸盐缓冲液（粉剂）配制，取该粉剂一包溶于 1000ml 的蒸馏水中，混匀，其 pH 值在 6.0 ± 0.1，如因蒸馏水本身造成的 pH 值偏差，请自行调整。 3.1 石蜡切片微波炉抗原修复操作方法：切片脱蜡至水后，3％H2O2 处理 10 分钟，蒸馏水洗 2 分钟× 3。将切片放入盛有枸橼酸盐缓冲液（工作液）的容器中，置微波炉内加热使容器内液体温度保持 在 92℃~98℃之间并持续 10~15 分钟（注意：无论是使用医用或家用微波炉，请根据具体机型酌情设置 条件，务必满足以上步骤中对温度和时间的要求）。取出容器，室温冷却 10~20 分钟（注意：不可将 切片从缓冲液中取出冷却，以便使蛋白能够恢复原有的空间构型）。PBS 洗，下接免疫组化染色步骤。 3.2 石蜡切片高压抗原修复操作方法：切片脱蜡至水。将 1500ml~3000ml 的枸橼酸盐缓冲液（工作液） 注入不锈钢压力锅中加热至沸腾。切片置于金属架上，放入锅内，使切片位于液面以下，盖锅压阀。 当压力锅开始慢慢喷气时（约加热 5~6 分钟后），计时 1~2 分钟，然后将压力锅端离热源，冷水冲至 室温后，取下气阀，打开锅盖，取出切片，蒸馏水洗后，PBS 洗 2 分钟×3，下接免疫组化染色步骤。 3.3 石蜡切片电炉煮沸抗原修复操作方法：切片脱蜡至水后，放入盛有枸橼酸盐缓冲液（工作液）的 容器中，并将此容器置于盛有一定数量自来水的大器皿中，电炉上加热煮沸，从小容器的温度到 达 92℃~98℃起开始计时 15~20 分钟，然后端离电炉，室温冷却 20~30 分钟，蒸馏水冲洗，PBS 洗，下 接免疫组化染色步骤。 4、免疫组化染色步骤： （以美国 ZYMED 公司 SP 试剂盒为例） 4.1 石蜡切片脱蜡至水。 4.2 3%H2O2 室温孵育 5~10 分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。 4.3 蒸馏水冲洗，PBS 浸泡 5 分钟，（如需采用抗原修复，可在此步后进行）。4.4 5~10％正常山羊血清（PBS 稀释）封闭，室温孵育 10 分钟。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀 释的一抗或一抗工作液，37℃孵育 1~2 小时或 4℃过夜。 4.5 PBS 冲洗，5 分钟×3 次。 4.6 滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%BSA-PBS 稀释），37℃孵育 10~30 分钟；或滴加第二代 生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育 10~30 分钟。 4.7 PBS 冲洗，5 分钟×3 次。 4.8 滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素（PBS 稀释），37℃孵育 10~30 分钟；或第二代辣根 酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育 10~30 分钟。 4.9 PBS 冲洗，5 分钟×3 次。 4.10 显色剂显色（DAB 或 AEC）。 4.11 自来水充分冲洗，复染，封片。 冰冻切片免疫组化染色步骤 冰冻切片 4~8µm，室温放置 30 分钟后，入 4℃丙酮固定 10 分钟，PBS 洗，5 分钟×3。用 3％过氧化 氢孵育 5~10 分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。PBS 洗，5 分钟×2。 服务内容 （一）分析服务一 1.不同组数据表达量分析（平均值±标准差）； 2.利用生物作图软件做柱状图、三线表格、折线图等（分辨率不低于600dpi）。通过生物统计软件分析各组之间的统计学差异；给出具体p值、t值或者F值等；同时标记在相应柱状图或者三线表格中。 （二）分析服务二 1.不同组数据表达量分析（平均值±标准差）； 2.利用生物作图软件做柱状图、三线表格、曲线图等。通过生物统计软件分析各组之间的统 计学差异；给出具体p值、t值或者F值等；同时标记在相应柱状图或者三线表格中； 3.组合Merger图片绘制：将各组（指标）各挑选一张典型照片，联合柱状图或者折线图，通过生物作图软件，绘制Merger图片；提高图片在文章中的反应信息，同时降低版面占比。 三 客户提供数据要求 1.原始数据、原始图片（dpi≥600）及其拍照倍数（100倍、200倍或400倍）； 2.检测样本的分组信息，样本若为细胞则标注种属和细胞名称，样本若为组织则标注检测种 属和部位； 3.若需要做柱状图和统计学分析，请提供多次重复数据； 4.若需要做柱状图和统计学分析，请提供每组样本5个不同视野下的图片或计数结果； 5.实验的研究内容及目的。 |
