通用型细菌鉴定16S rDNA PCR扩增检测试剂盒产品说明书(中文版)
主要用途
通用型细菌鉴定16S rDNA PCR扩增检测试剂是一种旨在根据保守性序列设计引物，针对微生物样本DNA进行PCR扩增，进一步测序后借助分析工具予以同源比较，由可变序列识别和分类微生物样品的而经典的技术方法。该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的。可以被用于各种微生物的鉴定、归类、建树等系统微生物学的研究。产品即到即用，性能稳定，操作简便，扩增效率显著。
技术背景
16SrRNA作为非培养依赖性标记的分子指模（fingerprinting）技术，有别于传统的选择性培养技术，用于研究微生物的分类学（phylogenetics）。核糖体RNA（ribosome RNA）存在于所有微生物体内，且结构与功能进化保留；容易分离和识别；其一级和二级结构具有高度进化保守区域（conserved region）和物种特异性可变区域（variable region）；其基因序列变异非常缓慢，且不会发生平行基因转移（horizontal gene transfer）。其包括5S、16S、23S。5S信息量不够充分；23S不稳定；而微生物16SrRNA基因较为稳定，初级结构含有1500个碱基。通过引物设计，扩增产物测序，数据库对照，鉴定微生物的类别或建立新的微生物在进化树上的位置。
产品内容
扩增液（Reagent A） 微升
引物液（Reagent B） 微升
补充液（Reagent C） 毫升
测序引物A（Reagent D） 微升
测序引物B（Reagent E） 微升
产品说明书 1份
保存方式
保存在－20℃冰箱里；有效保证6月
用户自备
PCR级矿物油：用于封隔反应液
PCR仪：用于样品扩增
PCR管或平板：用于PCR反应的容器
琼脂糖凝胶电泳：用于扩增后电泳分析
实验步骤
实验开始前，从－20℃冰箱中取出试剂，放进冰槽里融化。然后进行下列操作： 1
300
40
20
20
7
加入2
1． 针对一个样本，每次移出 15 微升 扩增液（Reagent A）到 PCR 管
2． 加入 1 微升用户自备的的待测 DNA 样品（总量 100 纳克）
3． 微升 引物液（Reagent B）
4． 再加入 微升 补充液（Reagent C）（反应总量为 25 微升）
5． 即刻放进微型台式离心机瞬时离心 5秒，速度为500g（或2000RPM；例如 eppendorf 5415）
6． （选择步骤）加入 50微升用户自备的 PCR 级矿物油（注意：参见注意事项 13）
7． 即刻进行热启动 PCR 反应：
温度（℃）
时间
循环
95
2分钟
1
95
45
70
1分钟
1分钟
1分钟
30
70
5分钟
8． 反应完毕后，移取5微升进行1.0%琼脂糖凝胶电泳：产物为1.5kb左右
9． 如果继续测序鉴定，胶回收PCR产物（建议使用）
10．分别移出2微升用户自备的测序反应液到2个不同的新的1.5毫升离心管
11．加入1微升测序引物A（Reagent D）到其中一个1.5毫升离心管，作好标记
12．加入1微升测序引物B（Reagent E）到另一个1.5毫升离心管，作好标记
13．进行后续的测序反应
注意事项
1． 本产品为20次操作
2． 操作时，须戴手套
3． 建议使用带滤芯的枪头，避免污染
4． 在－20℃冰箱里储存的产品避免反复冻融
5． 建议样品为纯培养微生物的DNA；DNA提取应确保高纯度
6． 可以使用菌落直接检测：用无菌枪头点触
7． 如果没有扩增条带，可以直接测序，或询问特殊引物设计服务
8． 可以直接使用纯化的基因组DNA进行测序
9． 可以将扩增产物纯化后，克隆到质粒中，然后进行测序
10．测序引物A（Reagent D）为上游引物，可以获得500至1500的序列；引物序列为：
5－CAGCAGCCGCGGTAATAC3
11．测序引物B（Reagent E）为下游引物，可以获得0至500的序列；引物序列为：
5－GTATTACCGCGGCTGCTG－3
12．测序建议优先使用测序引物B（Reagent E），其可变区域较为特征
13．根据用户PCR仪的性能，决定是否加入矿物油（Mineral Oil）
14．建议使用软件测算Tm温度；参考公式为Tm=4（G+C）+2（A+T）
15．本公司提供16SrDNA特异性引物设计服务
16．测序后，序列分析和微生物分类分析工具参考如下：
1）样品序列与数据库已知微生物序列的比对（BLAST） 2
高质纯化胶回收试剂盒
http://www.ncbi.nlm.nih.gov
2）样品序列的分类学分析前的预编辑
http://iubio.bio.indiana.edu/soft/molbio/docs/biosoft-free.html
3）样品的进化树的确立
http://evolution.genetics.washington.edu/phylip.html
http://www.lms.si.edu/PAUP
4）16SrRNA 数据库
http://www.mikro.biologie.tu-muenchen.de
17．本公司提供系列细菌 16S rDNA 扩增检测试剂产品
质量标准
1． 本产品经鉴定性能稳定
2． 本产品经鉴定无核酶污染
3． 本产品经鉴定检测准确