植物染色质免疫沉淀分析（CHIP）试剂盒
产品说明书
主要用途
植物染色质免疫沉淀分析（CHIP）试剂是一种旨在通过甲醛交联、物理或化学处理细胞核
以及染色质，从而运用特异抗体结合免疫沉淀，然后萃取DNA，扩增分析，来确定结合蛋
白的目标DNA 序列的而经典的技术方法。该技术由大师级科学家精心研制、成功实验
证明的。其适用于DNA 复制、重组、修复、转录、病毒组装中的DNA 和蛋白质（包括转
录因子、聚合酶、组蛋白等）的相互作用的研究。广泛应用于定性检测各种植物组织（花瓣、
叶片、种子等）DNA 蛋白结合序列和定量检测序列特异性DNA 结合蛋白（例如转录因子）
及其突变形成等。产品即到即用，性能稳定，操作便捷，反应敏感，结合显著，重复性好。
技术背景
DNA 和蛋白质的相互作用是调控细胞反应过程的要素之一。染色质免疫沉淀分析方法
（chromatin immunoprecipitation；CHIP）是研究活体内（in vivo）DNA 和蛋白质的相互作
用的zui有力的工具：用于分析染色质结构动力学、转录因子调节、以及表观遗传学变异
等。CHIP 技术通过三大步骤实现：*，甲醛固定后染色质分离和断片；第二，运用特异
蛋白之抗体，免疫共沉淀结合蛋白（包括转录因子、聚合酶、组蛋白等）的染色质片断；第
三，分析目标DNA 和蛋白的修饰。其中转录因子作为调节蛋白，通过结合核DNA，以达
到控制基因表达。
产品内容
清理液（Reagent A） 毫升
固着液（Reagent B） 毫升
终止液（Reagent C） 毫升
裂解液A（Reagent D） 毫升
裂解液B（Reagent E） 毫升
裂解液C（Reagent F） 毫升
核溶液（Reagent G） 毫升
稀释液（Reagent H） 毫升
结合液（Reagent I） 毫升
低盐液（Reagent J） 毫升
高盐液（Reagent K） 毫升
平衡液（Reagent L） 毫升
缓冲液（Reagent M） 毫升
洗脱液（Reagent N） 毫升
解联液（Reagent O） 毫升
酶解液（Reagent P） 微升
萃取液（Reagent Q） 毫升
浓缩液（Reagent R） 毫升
沉淀液（Reagent S） 毫升
净化液（Reagent T） 毫升
扩增液（Reagent U） 微升
补充液（Reagent V） 毫升
说明书1 份
保存方式
保存裂解液A（Reagent D）、裂解液B（Reagent E）、裂解液C（Reagent F）、核溶液（Reagent
G）、稀释液（Reagent H）、结合液（Reagent I）、解联液（Reagent O）、酶解液（Reagent P）、
萃取液（Reagent Q）、浓缩液（Reagent R）和扩增液（Reagent U）在－20℃冰箱里，其余
的保存在4℃冰箱里； 有效保证6 月
用户自备
特异抗体：用于目标蛋白的结合
特异引物：用于目标DNA 的扩增或测序
1.5 毫升离心管：用于样品反应操作和保存的容器
2 毫升离心管：用于样品反应操作和保存的容器
15 毫升锥形离心管：用于样品处理的容器
50 毫升锥形离心管：用于植物组织处理的容器
恒温水槽：用于孵育反应物
震荡器：用于混匀反应物
4℃微型台式离心机：用于沉淀样品
4℃台式离心机：用于沉淀样品
平式摇荡仪或摇床：用于孵育和混匀反应
DOUNCE 匀浆器：用于裂解植物组织细胞
超声仪：用于裂解植物组织细胞核
PCR 仪：用于扩增反应
电泳仪：用于检测扩增产物
实验步骤
实验开始前，准备好待测植物的预处理：药物处理等。同时将－20℃保存的试剂置于冰槽里
融化。然后进行下列操作。
一、植物组织细胞核分离
1． 准备好新鲜处理的植物组织（花瓣、叶片、种子等），并秤重1 克组织重量
2． （选择步骤）放进预冷的50 毫升锥形离心管
3． （选择步骤）加入毫升清理液（Reagent A）清洗1 次
4． 即刻用刀片切碎组织
5． 或置于液氮管过夜，次日取出后，即刻（zui快速度）碾碎组织成粉末（注意：切莫使组
织冻融）
6． 放进15 毫升锥形离心管
7． 加入毫升室温预热的固着液（Reagent B）
8． 平放置于摇床，室温下（25℃）孵育15 分钟，速度为100RPM
9． 加入微升室温预热的终止液（Reagent C）
10．继续平放置于摇床，室温下（25℃）孵育5 分钟，速度为100RPM
11．放进台式离心机离心5 分钟，速度为1000g
12．小心抽去上清液
13．加入毫升预冷的清理液（Reagent A），混匀
14．放进4℃台式离心机离心5 分钟，速度为1000g
15．小心抽去上清液
16．重复实验步骤13 至15 二次
17．加入毫升预冷的裂解液A（Reagent D），混匀
18．涡旋震荡5 秒，充分混匀
19．置于冰槽里孵育10 分钟
20．即刻放入预冷的DOUNCE 匀浆器
21．在冰槽里用研磨棒匀化组织（约80 下）（注意：参见注意事项6）
22．（选择步骤）准备1 个小型漏斗，内衬尼龙丝，置于15 毫升锥形离心管上
23．（选择步骤）将所有组织匀浆物移入到小型漏斗里过滤
24．将所有组织匀浆物移入15 毫升锥形离心管
25．放进4℃台式离心机离心20 分钟，速度为2000g
26．小心抽去上清液
27．加入毫升裂解液B（Reagent E），混匀颗粒群
28．转移到1.5 毫升离心管
29．放进4℃微型台式离心机离心10 分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如EPPENDORF
5415）
30．小心抽去上清液
31．加入微升裂解液C（Reagent F），混匀颗粒群
32．准备1 个新的1.5 毫升离心管
33．加入微升裂解液C（Reagent F）
34．小心加入微升上述样品悬液在裂解液C（Reagent F）的上面
35．放进4℃微型台式离心机离心60 分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如EPPENDORF
5415）
36．小心抽去上清液
37．加入毫升核溶液（Reagent G），混匀颗粒群
38．置于冰槽里孵育10 分钟
39．置于200 瓦超声仪下，功率50％，猝击20 秒，间隙10 秒冷却，重复3 次（注意：根
据DNA 段大小，增加超声次数）
40．放进4℃微型台式离心机离心10 分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如EPPENDORF
5415）
41．小心移取上清液分装到10 个2 毫升离心管（100 微升/管）
42．其中： 1）选择1 管进行1：50 稀释后，测定OD260，确定DNA 含量，使所有样品的
检测浓度调整一致（注意：建议OD260＝0.1 为佳）
2）或选择1 管进行蛋白浓度检测，使所有样品的检测浓度调整一致（注意：蛋白总量1 至
5 毫克为佳；
3）或选择1 管进行去交联以及电泳鉴定超声处理的DNA 段（0.3 至1.5kb）（注意：参见
注意事项7）
43．选择1 管继续后续操作，其余的保存在－70℃冰箱里
44．加入微升稀释液（Reagent H）
二、结合反应
1． 加入微升结合液（Reagent I）
2． 平放置于4℃摇床孵育1 小时，速度为100RPM
3． 放进4℃微型台式离心机离心1 分钟，速度为400g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）
4． 小心移取上清液到2 个新的2 毫升离心管（每管500 微升：1 管为无抗体对照；1 管为
抗体处理管）
5． 加入50 微升用户自备的特异抗体（总量为5 微克）到抗体处理管
6． 将对照和抗体管平放置于4℃摇床孵育16 小时，速度为100RPM
7． 加入微升结合液（Reagent I）到抗体处理管
8． 将对照和抗体管平放置于4℃摇床孵育2 小时，速度为100RPM
9．将抗体管放进4℃微型台式离心机离心1 分钟，速度为400g（或2000RPM，例如eppendorf
5415）
10．小心抽去上清液
11．加入毫升低盐液（Reagent J）到抗体管，混匀
12．平放置于4℃摇床孵育5 分钟，速度为100RPM
13．放进4℃微型台式离心机离心1 分钟，速度为400g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）
14．小心抽去上清液
15．加入毫升高盐液（Reagent K）到抗体管，混匀
16．平放置于4℃摇床孵育5 分钟，速度为100RPM
17．放进4℃微型台式离心机离心1 分钟，速度为400g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）
18．小心抽去上清液
19．加入毫升平衡液（Reagent L）到抗体管，混匀
20．平放置于4℃摇床孵育5 分钟，速度为100RPM
21．放进4℃微型台式离心机离心1 分钟，速度为400g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）
22．小心抽去上清液
23．加入毫升缓冲液（Reagent M）到抗体管，混匀
24．平放置于4℃摇床孵育5 分钟，速度为100RPM
25．放进4℃微型台式离心机离心1 分钟，速度为400g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）
26．小心抽去上清液
27．重复实验步骤23 至26 一次
28．加入微升洗脱液（Reagent N）到抗体管，混匀
29．平放置于摇床，室温下孵育15 分钟，速度为100RPM
30．放进4℃微型台式离心机离心3 分钟，速度为400g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）
31．小心移取上清液到新的2 毫升离心管
32．重复实验步骤28 至31 一次
33．小心移取上清液合并到上述2 毫升离心管（注意：可以暂时停止，存放在－20℃，次日
继续）
三、DNA 萃取
1． 分别加入微升解联液（Reagent O）到抗体处理管和无抗体对照管，混匀
2． 置于65℃恒温水槽孵育2 小时
3． 分别加入微升酶解液（Reagent P）
4． 置于55℃恒温水槽孵育2 小时
5． 室温下静置15 分钟
6． 分别加入微升萃取液（Reagent Q）（注意：使用前摇匀）
7． 涡旋震荡15 秒
8． 放进微型台式离心机离心5 分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
9． 分别移出450 微升上层液相溶液到2 个新的2 毫升离心管（注意：切莫触碰液相交界面
上的白色膜状物）
10．分别加入微升浓缩液（Reagent R）到新的离心管
11．分别加入毫升沉淀液（Reagent S）
12．涡旋震荡15 秒
13．放进微型台式微型离心机离心15 分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf
5415）（注意：离心前做好方位标记，以便离心后观察管底沉淀颗粒）
14．小心抽掉上清液
15．分别加入毫升净化液（Reagent T）
16．放进微型台式离心机离心5 分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
17．小心抽掉上清液
18．空气中晾干沉淀颗粒群
19．分别加入微升缓冲液（Reagent M）
20．溶解后放进－20℃冰箱保存
四、PCR 扩增
1． 将扩增液（Reagent U）和补充液（Reagent V）从－20℃冰箱里取出
2． 置入冰槽里直至融化
3． 针对一个样本，每次移出微升扩增液（Reagent U）到PCR 管
4． 加入2 微升上述结合实验中获得的DNA 样品（总量100 纳克）
5． 分别加入1 微升用户自备的特异性的引物F 和引物R（各350 纳克或25 微摩尔）
6． 再加入微升补充液（Reagent V）（反应总量为25 微升）
7．即刻放进微型台式离心机瞬时离心5 秒，速度为500g（或2000RPM；例如eppendorf 5415）
8． 加入50 微升PCR 级矿物油（注意：参见注意事项9）
9． 即刻进行热启动PCR 反应：
温度（℃） 时间循环
95 2 分钟1
95
Tm
72
30 秒
1 分钟
30 秒
35
72 5 分钟1
10．反应完毕后，移取5 微升进行1.5%琼脂糖凝胶电泳
11．如果进行测序鉴定，胶回收PCR 产物（建议使用高质纯化一步法胶回收试剂盒；
12．分别移出2 微升反应液到2 个不同的新的1.5 毫升离心管（每微升100 纳克）
13．加入1 微升用户自备的特异性巢式引物F（每微升350 纳克）到其中一个1.5 毫升离心
管，作好标记
14．加入1 微升用户自备的特异性巢式引物R（每微升350 纳克）到另一个1.5 毫升离心管，
作好标记
15．进行后续的直接测序反应
注意事项
1． 本产品为10 次（1 克植物组织样本）操作
2． 操作时，须戴手套
3． 固着处理必须在室温下进行，其余的操作均须在4℃状态进行
4． 严格按照操作规程进行
5． 建议使用无抗体对照
6． 通常匀化次数为80 下达到80％的组织细胞裂解为理想状态，但不同的组织类型会存在
差异。用户可以通过显微镜观察3 微升匀浆物的组织细胞裂解程度：完整细胞呈现发亮的圆
环。低于50％可以增加匀化次数
7． 通常超声处理后的DNA 段大小为0.3 至1.5kb；如果使片段小于1.0kb，增加超声次
数或功率即可。电泳鉴定前，加入10 微升解联液（Reagent O）到1 管100 微升超声处理后
样品，65℃孵育4 小时，移取20 微升进行1.0％琼脂糖凝胶电泳。其标准片段电泳图象如下：
泳道1 为DNA 标准样；泳道2 为未经超声处理样品；泳道3 为超声处理后样品；泳道4 为
强化超声处理后样品
8． 根据用户PCR 仪的性能，决定是否加入矿物油（Mineral Oil）
9． 建议使用软件测算Tm 温度；参考公式为Tm=4（G+C）+2（A+T）
10．在－20℃冰箱里储存的产品避免反复冻融
11．本公司提供系列CHIP 分析试剂产品
质量标准
1． 本产品经鉴定性能稳定
2． 本产品经鉴定不含污染性蛋白酶和核酶