革兰氏阴性细菌外膜囊泡制备试剂盒产品说明书 主要用途 革兰氏阴性细菌外膜囊泡制备试剂是一种旨在使用差速离心，分离并收集所有细胞外膜囊泡的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。适合于各种革兰氏阴性细菌外膜囊泡及其蛋白的纯化。产品即到即用，性能稳定，操作便捷，萃取产量和纯度皆佳。 技术背景 外膜囊泡（outer membrane vesicle；OMV）为含有周质内容物（包括外膜蛋白、DNA、RNA、脂多糖、脂质、周质蛋白、黏附素、免疫调节化合物等）的球形电子致密芽状体（spherical bud），细胞外间隔体，双层磷脂，20至200纳米大小，来自于革兰氏阴性细菌周边突起物的释放形成或胞外分泌产物，使之与环境或宿主细胞进行反应，并调解各种功能，包括促进病理形成，调节细菌互动，转运各种信号分子（例如DNA、RNA、蛋白质、内毒素、毒力因子等），保护细菌生存、结合和侵入，引起毒性，产生抗生素抗性等。外膜囊泡的产量取决于细菌生长周期、营养条件、温度、氧化应激状态等。病原菌的外膜囊泡10倍于非病原菌体。外膜囊泡具有疫苗开发中免疫调节潜力。通过差速离心和蛋白酶抑制混合剂，获得高纯外膜囊泡，充分保留其蛋白质的免疫和生物学活性。 产品内容 保存液（Reagent A） 毫升 溶解液（Reagent B） 毫升 活性液（Reagent C） 微升 产品说明书 1份 保存方式 保存活性液（Reagent C）在-20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里，有效保证6月 用户自备 50毫升锥形离心管：用于样品操作的容器 1.5毫升离心管：用于样品保存的容器 分光光度仪：用于测定细菌浓度 台式离心机：用于样品操作 超速离心机：用于样品操作 恒温摇床：用于培养细菌细胞 0.45微米滤膜：用于样品操作 真空浓缩装置：用于样品操作 实验步骤 实验开始前，将试剂盒里的活性液（Reagent C）从－20℃的冰箱里取出，置入冰槽里冻融，然后移出xx毫升溶解液（Reagent B）到1.5毫升离心管，加入xx微升活性液（Reagent C），充分混匀，置于冰槽里，标记为溶解工作液。然后进行下列操作。 - 准备好1毫升过夜培养的新鲜细菌样品
- 移取500微升到50毫升细菌培养液（注意：用户可以进行诱导培养，例如无铁培养等）
- 放进37℃恒温摇床孵育过夜，速度为200RPM
- 在分光光度仪上测OD600为1（1 OD＝1 X 109细胞/毫升；总量为5 X 1010细胞）
- 转移到预冷的50毫升锥形离心管
- 放进4℃台式离心机离心30分钟，速度为5000g
- 小心移取上清液到新的50毫升锥形离心管
- 重复实验步骤6和7一次
- 使用0.45微米滤膜真空过滤一次
- （选择步骤）使用100kD蛋白临界点浓缩处理
- 放进4℃超速离心机离心3小时，速度为150000g
- 小心抽去上清液
- 加入xx微升预冷的保存液（Reagent A）
- 或加入xx微升预冷的含有 溶解液（Reagent B）和活性液（Reagent C）的溶解工作液
- 用枪头上下抽吸，充分混匀
- 转移到到新的预冷的1.5毫升离心管
- 即刻放进－70℃冰箱里保存或置于冰冰槽里备用
- 进行后续蛋白定量、荧光定量或电镜检测等
注意事项 - 本产品为20次（50毫升菌液）操作
- 所有操作须在4℃状态下进行
- 建议使用新鲜细菌接种，培养到指数生长阶段为理想状态
- 活性液（Reagent C）避免反复冻融
- 本产品按照50毫升培养菌液配制。如果操作不同菌液容量，可相应调整试剂用量
- 根据菌种不同，50毫升（OD600＝1）菌液可获得5至100微克外膜囊泡蛋白
- 制备产物如果放在－70℃冰箱里储存备用，严格避免反复冻融
- 本公司提供系列细菌试剂产品
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