动物血小板线粒体粗提分离试剂盒产品说明书 主要用途 动物血小板线粒体粗提分离试剂是一种旨在通过低速差速离心和化学渗压休克处理纯化血小板、以及物理或化学破膜和高速差速离心的方法，直接从动物血细胞中分离出完整而纯化的血小板线粒体细胞器，然后进一步生物酶处理以获得高质量的线粒体DNA的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。各种动物血细胞中血小板线粒体核酸成分处理。用于后续的杂交、克隆、酶切、PCR分析等。产品即到即用，操作简易，性能稳定，无核酶污染，萃取纯度和产量皆高。 技术背景 线粒体细胞器的研究是现代细胞生物学的zui重要的课题之一。线粒体成为生物衰老、古生物、细胞凋亡、肿瘤、HIV、老年痴呆症、糖尿病、肌肉疾病等研究的主要对象。线粒体DNA的分离和定量以及突变分析是研究中*的。 产品内容 清理液（Reagent A） 500毫升 裂解液（Reagent B） 80毫升 净化液（Reagent C） 20毫升 强化液（Reagent D） 10毫升 保存液（Reagent E） 100毫升 破膜液（Reagent F） 6毫升 去干扰液（Reagent G） 600微升 酶解液（Reagent H） 600微升 萃取液（Reagent I） 6毫升 浓缩液（Reagent J） 2毫升 助沉液（Reagent K） 20微升 沉淀液（Reagent L） 20毫升 纯化液（Reagent M） 20毫升 缓冲液（Reagent N） 1毫升 产品说明书 1份 保存方式 保存净化液（Reagent C）、去干扰液（Reagent G）、酶解液（Reagent H）、萃取液（Reagent I）和助沉液（Reagent K）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里，有效保证6月 用户自备 15毫升锥形离心管：用于样品操作的容器 50毫升锥形离心管：用于样品操作的容器 1.5毫升离心管：用于样品保存的容器 4℃（微型）台式离心机：用于样品操作 4℃超速离心机：用于样品操作 DOUNCE匀浆器：用于裂解细胞 超声仪：用于裂解细胞 58℃恒温水槽：用于孵育反应物 实验步骤 实验开始前，将试剂盒里的净化液（Reagent C）冻融，然后移出1毫升净化液（Reagent C）到4毫升的裂解液（Reagent B）里，混匀后，置入冰槽里，标记为裂解工作液。然后进行下列操作。 - 准备1个无菌的50毫升锥形离心管
- 轻轻混匀10至20毫升新鲜（2小时内抽取的静脉血）的抗凝全血样品
- 移入到50毫升锥形离心管
- 放进台式离心机离心15分钟，速度为200g
- 小心移取上清液到新的50毫升锥形离心管，留下200微升液体，以防抽取松动的细胞颗粒群
- 用手指轻弹离心管2至3下，使细胞颗粒群松动
- 加入10毫升预冷的清理液（Reagent A），混匀细胞颗粒群
- 放进台式离心机离心15分钟，速度为200g
- 小心移取上清液合并到上述50毫升锥形离心管，留下200微升液体，以防抽取松动的细胞颗粒群（扔掉含有细胞颗粒群的离心管）
- 放入含有上清液的离心管到台式离心机离心15分钟，速度为200g
- 小心移取上清液到新的50毫升锥形离心管，留下200微升液体，以防抽取松动的细胞颗粒群（扔掉含有细胞颗粒群的离心管）――此步骤获得血小板富集血清
- 放入含有上清液的离心管到台式离心机离心20分钟，速度为2000g
- 可见白色沉淀颗粒群，小心抽掉上清液
- 加入10毫升预冷的清理液（Reagent A），混匀细胞颗粒群
- 放入台式离心机离心20分钟，速度为2000g
- 小心抽去上清液（注意：如果暂时停止操作，须暂时放进－70℃冰箱里）――此步骤获得纯化的血小板
- 加入5毫升预冷的裂解工作液
- 涡旋震荡5秒，充分混匀细胞颗粒群
- 即刻放进预冷的DOUNCE匀浆器，在冰槽里用匀浆帮匀化细胞（约20至40下）（注意：参见注意事项11）
- 将所有细胞匀浆物移入15毫升锥形离心管
- （选择步骤）置于超声仪枪头下，离心管在冰槽里
- （选择步骤）超声功率为60％（或150赫兹）猝击10秒，间隙30秒，10个循环
- 放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为1500g
- 小心移出上清液到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管——此步骤去除未溶解的细胞
- 放进4℃超速离心机离心10分钟，速度为10000g
- 小心抽去上清液，保留沉淀颗粒——此步骤获得线粒体沉淀物
- 化学处理法
实验开始前，将试剂盒里的净化液（Reagent C）冻融，然后移出1毫升净化液（Reagent C）到4毫升的裂解液（Reagent B）里，混匀后，置入冰槽里，标记为裂解工作液。然后进行下列操作。 - 准备1个无菌的50毫升锥形离心管
- 轻轻混匀10至20毫升新鲜（2小时内抽取的静脉血）的抗凝全血样品
- 移入到50毫升锥形离心管
- 放进台式离心机离心15分钟，速度为200g
- 小心移取上清液到新的50毫升锥形离心管，留下200微升液体，以防抽取松动的细胞颗粒群
- 用手指轻弹离心管2至3下，使细胞颗粒群松动
- 加入10毫升预冷的清理液（Reagent A），混匀细胞颗粒群
- 放进台式离心机离心15分钟，速度为200g
- 小心移取上清液合并到上述50毫升锥形离心管，留下200微升液体，以防抽取松动的细胞颗粒群（扔掉含有细胞颗粒群的离心管）
- （选择步骤）放入含有上清液的离心管到台式离心机离心15分钟，速度为200g
- （选择步骤）小心移取上清液到新的50毫升锥形离心管，留下200微升液体，以防抽取松动的细胞颗粒群（扔掉含有细胞颗粒群的离心管）――此步骤获得血小板富集血清
- 放入含有上清液的离心管到台式离心机离心20分钟，速度为2000g
- 可见白色沉淀颗粒群，小心抽掉上清液
- 加入10毫升预冷的清理液(Reagent A)，混匀细胞颗粒群
- 放入台式离心机离心20分钟，速度为2000g
- 小心抽去上清液（注意：如果暂时停止操作，须暂时放进－70℃冰箱里）――此步骤获得纯化的血小板
- 入5毫升预冷的裂解工作液
- 涡旋震荡5秒，充分混匀
- 在冰槽里孵育2分钟，期间涡旋震荡5秒一次
- 加入500微升预冷的强化液（Reagent D）
- 涡旋震荡5秒，充分混匀
- 在冰槽里孵育5分钟，期间涡旋震荡5秒二次（注意：参见注意事项12）
- 加入5毫升预冷的保存液（Reagent E），轻轻摇动试管混匀
- 放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为1500g
- 小心移出上清液到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管——此步骤去除未溶解的细胞
- 放进4℃超速离心机离心10分钟，速度为10000g
- 小心抽去上清液，保留沉淀颗粒——此步骤获得线粒体沉淀物
- 线粒体DNA萃取
- 加入300微升破膜液（Reagent F）到线粒体颗粒样品中
- 涡旋震荡15秒，混匀颗粒群
- 转入1.5毫升离心管
- 置入冰槽中孵育15分钟
- 加入30微升去干扰液（Reagent G）
- 用200微升枪头上下抽吸混匀
- 放进37℃恒温水槽孵育15分钟
- 加入30微升酶解液（Reagent H）
- 涡旋震荡15秒
- 放进58℃恒温水槽或干式恒温仪孵育2小时（注意：可以孵育4至16小时，增加萃取产量）
- 置于室温下冷却15分钟，直至处于室温状态（或置于冰槽里15至30秒）
- 加入300微升萃取液（Reagent I）（注意：使用前摇匀）
- 涡旋震荡15秒
- 放进微型台式离心机离心10分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
- 移出上层液相溶液到新的1.5毫升离心管（注意：切莫触碰液相交界面上的白色膜状物）
- 加入100微升浓缩液（Reagent J）
- 加入1微升助沉液（Reagent K）
- 加入800微升沉淀液（Reagent L）
- 在涡旋震荡仪上震荡15秒，充分混匀
- 放进微型台式微型离心机离心15分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）（注意：离心前做好方位标记，以便离心后观察管底沉淀颗粒）
- 小心抽掉上清液
- 加入1毫升纯化液（Reagent M）
- 放进微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
- 小心抽掉上清液
- 空气中晾干沉淀颗粒群
- 加入20微升缓冲液（Reagent N）
- 溶解后放进－20℃冰箱保存或移出2微升进行PCR反应
注意事项 - 本产品为20次（10至20毫升全血/次）操作
- 其它实际操作的全血容量与试剂使用量按比例调整：例如40毫升全血，试剂用量加倍
- 操作时，避免污染母液，尤其是裂解液（Reagent B）和保存液（Reagent E）
- 操作时，须戴手套
- 建议使用新鲜全血：2小时内的全血为理想状态，不要超过24小时
- 全血样品采集须使用全血样品采集须使用EDTA二钾血液抗凝液（ 12059.1）、ACD血液抗凝液（ 12059.4），或肝素钠血液抗凝液（ 12059.5）
- 建议使用足够的样品量
- 血小板提取量因人而异；如果不足，建议增加全血量
- 线粒体操作均须在4℃或以下状态下进行
- 建议严格控制操作时间
- 通常匀化次数为20至40下（或细胞颗粒群消失为止）达到80％的细胞裂解为理想状态。用户可以通过显微镜观察3微升匀浆物的细胞裂解程度：完整细胞呈现发亮的圆环。低于50％可以增加匀化次数
- 通常孵育5分钟（不宜超过5分钟）达到80％的细胞裂解为理想状态。用户可以通过显微镜观察3微升裂解物的细胞裂解程度：完整细胞呈现发亮的圆环。低于50％可以增加孵育时间和涡旋震荡次数
- 物理处理法是优先推荐的技术处理
- 通常每毫升全血平均可获得2 X 108血小板
- 通常10毫升全血的血小板线粒体含量为10至25微克线粒体蛋白
- 可以通过增加线粒体溶解时间（30分钟）和酶解时间（直至16小时），获得大量的DNA产量
- 从2.5 X108细胞中提取的线粒体DNA通常达1微克
- 本产品所获得的线粒体DNA纯度和产量zui为理想，确保无核DNA和外源性DNA污染
- 本公司提供系列线粒体试剂产品
质量标准 - 本产品经鉴定性能稳定
- 本产品经鉴定无核酶污染
- 本产品经鉴定萃取产量和纯化程度高
- 本产品经鉴定无基因组DNA污染
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