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HL50285.5植物磷脂酶C试剂盒实验流程
点击次数:1272 发布时间:2022-05-22

50285.5 v.A

 

植物磷脂酶C(Phospholipase C)活性酶连续循环反应比色法定量检测试剂盒

产品说明书

 

主要用途

 

植物磷脂酶C(Phospholipase C)活性酶连续循环反应比色法定量检测试剂是一种旨在通过磷脂酶C、碱性磷酸酶、氧化酶和过氧化酶酶连续反应系统中,在磷脂酶C抑制剂的存在下,所产生的红色产物醌亚胺染料,在分光光度仪下峰值的增高,即采用比色法来测定组织裂解样品中酶活性的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适合于各种植物组织,包括种子(seed)、叶片(leaf)、根(root)、胚胎叶(cotyledon)、上胚轴(epicotyl)或微粒体样品等磷脂酶C的活性检测。产品严格无菌,即到即用,操作简捷,性能稳定。

 

技术背景

 

磷脂酶(phospholipase),是一种脂质水解酶,催化磷脂的水解,产生脂肪酸和其它亲脂产物,参与磷脂代谢。磷脂酶家属有四种类型亚酶,包括A、B、C和D。磷脂酶A(phospholipase A;PLA)主要水解磷脂sn-1(磷脂酶A1催化)和sn-2(磷脂酶A2催化)位置上的乙酰基;磷脂酶B(phospholipase B;PLB)同时水解磷脂的sn-1和sn-2位置上的乙酰基,又称为溶血磷脂酶(lysophospholipase);磷脂酶C(phospholipase C;PLC;EC3.1.4.3)在磷酸基前(即磷酸和甘油之间)水解,释放二酰基甘油(diacylglycerol;DAG)和第二信使分子三磷酸肌醇(inositol triphosphate);磷脂酶D(phospholipase D;PLD)在磷酸基后水解,释放磷脂酸(phosphatidic acid)。哺乳动物磷脂酶D,又称为磷脂酰磷脂酸水解酶(Phosphatidylcholine phosphatidohydrolase),有2个异构体:磷脂酶D1和D2,存在于细胞质膜上。磷脂酶C,又称为酶(lecithinase)或α-毒素(α-toxin),在细菌培养液上清中存在,具有水解生物膜上(lecithin),因此会产生溶血、皮肤坏死性(dermonecrotic)和致命作用。磷脂酶C还可以水解鞘磷脂(sphingomylin),脑磷脂(phosphatidylethanolamine)等。在细胞信号传导通路上起着重要作用。植物磷脂酶C受到钙离子调节,在生物性或非生物性压力中发挥作用。其次通过调节脂质信号通路中,控制花粉管生长和植物发育。基于底),在磷脂酶C选择性抑制剂U73122存在与否的情况下,通过磷脂酶C的作用,水解产生为二酰基甘油),进而由碱性磷酸酶(alkaline phosphatase),后通过过氧化酶(peroxidase)系统,测定红色产物醌亚胺染料(quinoneimine dye)的峰值变化(500nm 波长),来定量分析磷脂酶C的活性。其连续循环反应系统为:

 

PLC 

Leicithin  +  H2O     →      Diacylglycerol  +  Choline phosphate

 

 Alkaline phosphatase 

Choline phosphate  +  H2O     →      Choline  +  Phosphate

 

choline oxidase

Choline  +  O2  +  H2O  → Betaine aldehyde  +  2 H2O2

 

            peroxidase

 2 H2O2  +  4-Aminoantipyrine  +  Phenol     →    2 H2O  +   Quinoneimine dye   

 

产品内容

 

清理液(Reagent A) 30毫升

裂解液(Reagent B) 10毫升

缓冲液(Reagent C)   5毫升

反应液(Reagent D) 600微升

酶促液(Reagent E) 600微升

底色液(Reagent F) 600微升

阴性液(Reagent G) 600微升

专性液(Reagent H) 100微升

产品说明书     1份

 

保存方式

 

保存清理液(Reagent A)在4℃,其余的保存-20℃冰箱里;底色液(Reagent F)避免光照;有效保证6月

 

用户自备

 

1.5毫升离心管:用于样品保存和反应操作的容器

15毫升锥形离心管:用于样品制备的容器

DOUNCE匀浆器:用于组织匀化

(微型)台式离心机:用于样品操作

200微升1厘米光径比色皿或96孔板:用于比色的容器

分光光度仪或酶标仪:用于比色分析

 

实验步骤

 

一、样品准备

 

1.准备好新鲜的植物组织(叶片、谷粒、种子等),并秤重以确定200至500毫克组织重量 

2.(选择步骤)放进预冷的15毫升锥形离心管

3.(选择步骤)加入3毫升清理液(Reagent A)清洗1次

4.即刻用刀片切碎组织

5.放进一个预冷的15毫升锥形离心管

6.加入预冷的1毫升裂解液(Reagent B)

7.涡旋震荡5秒,充分混匀

8.即刻放进预冷的DOUNCE匀浆器,在冰槽里用匀浆棒匀化组织(约80下)

9.将所有组织匀浆物移入1.5毫升离心管,放进4℃微型台式离心机离心10分钟,速度为5000g(或7500RPM,例如eppendorf 5415)

10.小心移出上清液(注意:不要触碰沉淀物)到另一个新的预冷的1.5毫升离心管

11.(选择步骤)如果上清液含有肉眼可见的残渣,重复离心5分钟一次,速度为5000g(或7500RPM,例如eppendorf 5415)

12.放进4℃微型台式离心机离心5分钟,速度为16000g(或13000RPM,例如eppendorf 5415)

13.小心移取1毫升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管

14.(选择步骤)放进4℃超速离心机离心60分钟,速度为105000g 

15.(选择步骤)小心移取1毫升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管

16.移取10微升进行蛋白定量检测(注意:建议使用 BCA蛋白质浓度定量试剂盒-30031.1)

17.即刻放进-70℃保存或置于冰槽里继续后续操作

 

二、测定准备

 

1.开启并设定好分光光度仪或酶标仪(温度为37℃):波长500nm,并置零 

2.从-20℃冰箱里取出试剂,置于冰槽里融化;底色液(Reagent F)避免光照

3.缓冲液(Reagent C)室温下均衡温度

 

三、背景对照测定

 

1.移取170微升缓冲液(Reagent C)到新的比色皿或96孔板

2.加入25微升反应液(Reagent D)

3.加入10微升阴性液(Reagent G)

4.在37℃温度下孵育10分钟

5.加入25微升酶促液(Reagent E)

6.加入20微升底色液(Reagent F)

7.上下倾倒数次,混匀 

8.在37℃温度下孵育30分钟,避免光照

9.即刻放进分光光度仪或酶标仪检测,此为背景空对照 

 

四、样品总活性测定

 

1.移取170微升缓冲液(Reagent C)到新的比色皿或96孔板

2.加入25微升反应液(Reagent D)

3.加入10微升待测样品(100微克蛋白)(注意:样品须清澈)

4.涡旋震荡5秒

5.在37℃温度下孵育10分钟

6.加入25微升酶促液(Reagent E)

7.加入20微升底色液(Reagent F)

8.上下倾倒数次,混匀

9.在37℃温度下孵育30分钟,避免光照

10.即刻放进分光光度仪或酶标仪检测,此为样品总活性读数  

 

五、样品非特异活性测定

 

1.移取160微升缓冲液(Reagent C)到新的比色皿或96孔板

2.加入10微升专性液(Reagent H)

3.加入10微升待测样品(100微克蛋白)(注意:样品须清澈)

4.在37℃温度下孵育15分钟

5.加入25微升反应液(Reagent D)

6.在37℃温度下孵育10分钟

7.加入25微升酶促液(Reagent E)

8.加入20微升底色液(Reagent F)

9.上下倾倒数次,混匀

10.在37℃温度下孵育30分钟,避免光照

11.即刻放进分光光度仪或酶标仪检测,此为样品非特异活性读数

 

六、计算样品活性

 

(1)样品总活性和非特异性活性

 

比色皿计算

 

[(样品读数-背景读数)X 0.25(体系容量;毫升)X样品稀释倍数]÷[0.01(样品容量;毫升)X 12(毫摩尔吸光系数)X 0.5 X 10(反应时间;分钟)]=单位/毫升 

 

转换:单位/毫升÷(样品蛋白浓度)毫克/毫升=单位/毫克

 

单位=微摩尔磷/分钟

 

96孔板计算

 

[(样品读数-背景读数)X 0.25(体系容量;毫升)X样品稀释倍数]÷[0.01(样品容量;毫升)X 12(毫摩尔吸光系数)X 0.5 X 0.6 (光径距离;厘米)X 10(反应时间;分钟)]=单位/毫升 

 

转换:单位/毫升÷(样品蛋白浓度)毫克/毫升=单位/毫克

 

单位=微摩尔磷/分钟

 

(2)样品特异活性

 

样品特异活性=样品总活性-样品非特异活性

 

注意事项

 

1.本产品为20次(10个样本)操作,包括背景对照

2.操作时,须戴手套

3.系统操作过程中,背景测定只需1次

4.样品须澄清,至关重要 

5.比色测定后,比色皿须清洗*

6.样本测定读数增高,表明具有酶活性

7.建议待测样本蛋白浓度为100微克/10微升;如果样本酶活性过低或过高, 则可以增加或降低样本量(本公司提供  BCA蛋白质浓度定量试剂盒-30031.1) 

8.如果待测样品浓度过高或过低,可以调整样品浓度

9.磷脂酶C单位活性定义为:在37℃,pH 7.3条件下,每分钟内能够释放1微摩尔磷所需的酶量作为一个活性单位

10.本公司提供系列磷脂酶检测试剂产品

 

质量标准

 

1.本产品经鉴定性能稳定

2.本产品经鉴定检测敏感

 

使用承诺

 

本公司秉着“信誉至上、客户满意、质量承诺”的宗旨为我们的用户提供产品和服务。用户收到货后,应按照产品说明书上的规定妥善保管并在有效期内使用。我们的产品在销售前已作严格的质量鉴定,保证说明书所述的使用效果。在货到后10天内若发现确属本产品的质量问题,请立即以书面形式(实验报告,并将该产品退回,经检验确系产品质量所致,本公司负责更换产品。如系使用者错误操作所致,本公司不承担由此造成的损失。

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