冰冻切片线粒体内膜功能（膜电位）荧光测定试剂盒产品说明书

主要用途

冰冻切片线粒体内膜功能（膜电位）荧光测定试剂是一种旨在通过高度敏感的阳离子荧光羰花青染料结合到线粒体基质，其荧光的增强或减弱说明线粒体膜电位的变化，即内膜电负性的增高或降低，来分析冰冻组织样品线粒体内膜功能的完整性的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种冰冻动物组织线粒体的功能检测。可以被用于细胞凋亡、信号传递、衰老等的研究。产品严格无菌，即到即用，活体检测，操作极为简易，性能稳定。

技术背景

阳离子荧光羰花青染色剂JC-1（5,5',6,6'-tetrachloro-1,1',3,3'-tetraethylbenzimidazolcarbocyanine iodide）是一种对膜电位高度敏感的染色剂。它特异性地进入线粒体，分布和结合在线粒体基质上。线粒体膜电位的高低变化决定了JC-1的分布浓度。电位高，JC-1形成聚集体，而浓度高，荧光显色为红色或桔红色；反之，则为绿色。荧光减弱表明线粒体内膜功能受到损害。

产品内容

染色液（Reagent A）     40微升

稀释液（Reagent B）      5毫升

清理液（Reagent C）      20毫升

产品说明书       1份

保存方式

保存清理液（Reagent C）在4℃冰箱里，其余的保存在－20℃冰箱里；染色液（Reagent A）避免光照；有效保证6月

用户自备

1.5毫升离心管：用于工作液配制的容器

培养箱：用于染色孵育

（共聚焦）荧光显微镜：用于冰冻切片组织细胞线粒体荧光定性分析

实验步骤

实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的染色液（Reagent A）置入冰槽里融化，稀释液（Reagent B）放进37℃恒温水槽里预热。然后移出10微升染色液（Reagent A）到新的1.5毫升离心管，加入890微升稀释液（Reagent B），混匀后，在冰槽里静置，并标记为染色工作液，放在暗室里。然后进行下列操作。

• 准备5片待测的厚为10微米的未经固着处理的冰冻切片
• 置于室温下，小心加上500微升预冷的清理液（ Reagent C），铺满整个切片表面
• 小心移去切片上的清理液（Reagent C）
• 小心加上200微升室温预热的染色工作液，铺满整个切片表面
• 在37℃湿润培养箱里，孵育20分钟（注意：避免液体蒸发）
• 小心移去切片上的染色工作液，避免光照
• 小心加上500微升清理液（Reagent C），铺满整个切片表面
• 小心移去切片上的清理液（Reagent C）
• 放上盖玻片或封片（注意：检测前置于冰槽里）
• 即刻在倒置荧光显微镜下进行观察（单滤波或双滤波）：

观察红色荧光：滤波器激发波长490nm，散发波长590nm或罗丹明（rhodamine）滤波器激发波长540nm，

              散发波长570nm或德州红（Texas Red）滤波器激发波长590nm，散发波长610nm--可见

              亮红色荧光；如果强度显著减弱，表明线粒体膜电位受到破坏

观察绿色荧光：滤波器激发波长490nm，散发波长530nm或荧光素（Fluorescein）滤波器激发波长490nm，

              散发波长520nm--如果绿色荧光强度显著增强，表明线粒体膜电位受到破坏，未结合JC

              -1染料在细胞浆里

注意事项

• 本产品为20次操作
• 操作时，须戴手套
• 染色工作液避免光照
• 用户根据实际需求，按比例配制试剂用量
• 根据不同组织类型，调整染色工作液的使用剂量（1：100至1：1000容量比），避免过度染色
• 建议切片组织染色完成后，即刻进行荧光检测分析
• 孵育时，避免光照
• 双滤波或双重测定：健康细胞和线粒体呈现红色；死亡或凋亡细胞及损伤线粒体呈现绿色
• 本公司提供系列线粒体试剂产品