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纯化线粒体肿胀光度法技术说明书
点击次数:967 发布时间:2019-07-24

纯化线粒体肿胀光度法测定试剂盒产品说明书

 

主要用途

 

纯化线粒体肿胀光度法测定试剂是一种旨在通过光度法检测线粒体的光散射性变化,即吸光峰值的变化,来实时分析和观察线粒体基质容积或线粒体膨胀性的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种纯化线粒体膨胀程度的定量检测。产品严格无菌,即到即用,活体检测,分辨率高,操作简捷,性能稳定。

 

技术背景

 

线粒体容积变化是衡量线粒体活性的基本参数。线粒体应对细胞对于药物、凋亡诱导、细胞周期变化等反应采取的活性变化,包括膜电位、氧消耗、以及膜通道孔(mitochondrial permeability transition pore;MPTP)功能等的改变。线粒体基质容量(mitochondrial matrix volume)成为检测线粒体活性和功能的指标。一旦各种因素包括凋亡刺激、活性氧影响导致线粒体膜通道孔开放或膜电位的消失,而导致线粒体容积增大,即线粒体膨胀(mitochondrial swelling),使线粒体的光散射性(light scattering)降低,通过分光光度仪520nm波长的吸光峰值的变化,定量分析线粒体的膨胀程度。该波长区域可以避免细胞色素和蛋白质的干扰。  

 

产品内容

 

缓冲液(Reagent A)                       20毫升

膨胀液(Reagent B)                      500微升

产品说明书               1份

 

保存方式

 

保存在4冰箱里,有效保证6月

 

用户自备

 

比色皿96孔板:用于线粒体光度分析的容器

分光光度仪或酶标仪:用于线粒体光度定量分析

 

实验步骤

 

实验开始前,开启并设定好分光光度仪(温度为25):波长520nm,间隔30秒测读1次,持续10分钟至30分钟,并置零

 

  • 样品膨胀度检测

 

  • 准备好待测的纯化线粒体样品:对照样品和处理样品
  • 分别移取20微升线粒体样品(总量为200微克)到比色皿或96孔板的对应孔里
  • 分别加入170微升缓冲液(Reagent A),混匀
  • 即刻放进分光光度仪或酶标仪(波长520nm):获得0分钟初始读数 
  • 动态测读1分钟或室温下静置1分钟
  • 即刻分别加入10微升膨胀液(Reagent B) 
  • 即刻放进分光光度仪或酶标仪(波长520nm):动态记录10分钟吸光值变化或设定时间点记录实际吸光值
  • 获得实际吸光读数:0分钟读数-10分钟吸光读数――实际吸光读数高,表明线粒体膨胀度高
  • 或构建线粒体膨胀-药物浓度关系曲线:纵座标(Y)为实际吸光读数,横座标(X)为药物浓度

 

二、诱导剂筛选检测

 

  • 准备好待测的纯化线粒体样品
  • 移取20微升线粒体样品(总量为200微克)到比色皿或96孔板的对应孔里
  • 加入170微升缓冲液(Reagent A),混匀
  • 即刻放进分光光度仪或酶标仪(波长520nm):获得0分钟初始读数 
  • 动态测读1分钟或室温下静置1分钟
  • 即刻加入10微升用户自备的待测诱导剂,混匀(注意:可以设定不同浓度梯度
  • 即刻放进分光光度仪或酶标仪(波长520nm):动态记录10分钟吸光值变化或设定时间点记录实际吸光值――吸光值降低,表明诱导剂作用增强
  • 构建线粒体膨胀诱导曲线:纵座标(Y)为实际吸光值 ,横座标(X)为时间(分钟)
  • 或构建线粒体膨胀-诱导剂浓度关系曲线:纵座标(Y)为实际吸光值,横座标(X)为诱导剂浓度

 

三、抑制剂筛选检测

 

  • 准备好待测的纯化线粒体样品
  • 移取20微升线粒体样品(总量为200微克)到比色皿或96孔酶标板的对应孔里
  • 加入160微升室温预热的缓冲液(Reagent A),混匀
  • 即刻放进分光光度仪或酶标仪(波长520nm):获得0分钟初始读数 
  • 动态测读1分钟或室温下静置1分钟
  • 加入10微升用户自备的待测抑制剂,混匀(注意:可以设定不同浓度梯度
  • 动态测读2分钟或室温下静置2分钟
  • 即刻加入10微升膨胀液(Reagent B),混匀
  • 即刻放进分光光度仪或酶标仪(波长520nm):动态记录10分钟吸光值变化或设定时间点记录实际吸光值――吸光值不变,表明抑制剂作用增强
  • 或构建线粒体膨胀-抑制剂浓度关系曲线:纵座标(Y)为实际吸光值,横座标(X)为抑制剂浓度

 

注意事项

 

  • 本产品为50次操作
  • 本产品用于线粒体膨胀度检测、以及诱导剂和抑制剂筛选
  • 操作时,须戴手套
  • 使用时,避免污染母液,尤其是缓冲液(Reagent A)
  • 线粒体样品中忌用磷酸盐、EDTA、钙镁离子等处理
  • 建议使用未经诱导或抑制处理的样品作为对照样品
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