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如何减少ELISA试剂盒实验中背景因素的影响?
点击次数:845 更新时间:2018-04-24

ELISA试剂盒实验的原理似乎很简单,不外乎固定抗原,添加一抗、二抗和底物,间中夹杂着

洗涤和封闭。然而,即使是平淡无奇的洗涤和封闭,如果做得不太好,也有可能毁了整个实验

。在实验结束时,我们是否能获得有意义的信息,这在很大程度上取决于结果的信噪比。背景

噪音会影响您对结果的判断。如何降低ELISA的背景,下面有一些tips。

洗涤很重要

洗涤步骤看似很无聊,其实很重要,因为如果未结合的材料(如非特异结合的抗体或检测试剂)

残留在微孔板中,那么它会增加背景噪音。如有必要,可增加洗涤液中的盐浓度,这会阻止非

特异结合反应。如果背景过高,而您怀疑洗涤不够时,可以尝试增加洗涤次数。

封闭更关键

封闭液的作用是让不相关的蛋白占据微孔板中潜在的结合位点。这就降低了可产生信号的抗体

非特异结合的机会。您当然也希望抗体只与目的蛋白结合吧。如果您的背景过高,怀疑封闭不

充分,那么您可以尝试使用更高浓度的封闭液,或适当延长封闭时间。

如果您一直被背景问题所困扰,那么也许您该花些时间来优化封闭液。这可能需要时间,但也

是值得的。目前主要有两种类型的封闭液:蛋白和非离子型去污剂。您使用的类型须取决于多

个因素,包括微孔板的表面试剂、吸附的抗原、您的抗体和检测试剂。好的封闭液应降低非特

异性结合,但它不应当与抗原、抗体或检测试剂发生相互作用。

zui常用的非离子型去污剂是Tween-20。这种封闭液便宜、稳定,在去除洗涤过程中的一些非特

异结合上很有用。但它们只在存在时起作用,因为很容易被洗掉。因此所有洗涤液中也必须添

加封闭液。请勿使用高浓度(正常浓度为0.01-0.1%),它会降低特异结合,产生假阴性。另一

个选择是使用蛋白和非离子型去污剂这两种封闭液,后者可协助洗涤过程中的封闭。

蛋白封闭液则有所不同,是*的。它们与开放位点结合并封闭,同时稳定与微孔板结合的抗

原分子。常用的蛋白封闭液包括牛血清白蛋白(BSA)、脱脂奶粉、正常血清和鱼明胶。血清组

分的内在多样性可使它有效拦截许多不同类型的分子相互作用。不过,它的缺点在于能与

Protein A和IgG抗体相互作用。解决这个问题的一种方法是使用鸡或鱼的正常血清。

抗体浓度须优化

我们通常会follow师兄师姐留下来的操作步骤,但是如果试剂稍有不同,则可能需要优化抗体

的量。记住,非特异的抗体结合会增加背景。为了防止这一点,切勿使用过多的一抗或二抗。

检测试剂要适量

另一点也很显而易见:切勿使用过多的检测试剂。如果浓度过高,或者未正确稀释,则会导致

高背景。也不要显色过度,如有必要,优化一下何时应加入终止液。

    如果您的ELISA不幸地遇到了高背景,那么也无需太担心,依次查看ELISA系统中的组分,

并排除可能存在的问题。悉心优化,相信很快就会有漂亮的结果。

上一章:ELISA试剂盒实验中的封闭液等常用试剂的配制 下一章:ELISA试剂盒检测方法的起源和原理
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