线粒体呼吸链复合物I 活性比色法定量检测试剂盒 产品说明书 主要用途 线粒体呼吸链复合物I(NADH-辅酶Q 还原酶)活性比色法定量检测试剂是一种旨在使用合成辅酶Q 同功类似物和特异性抑制剂,通过反应系统测定样品中还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)氧化后峰值的降低,即采用比色法测定样品中酶活性的而经典的技术方法。该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的。其适合于各种纯化线粒体样品(动物、人体、酵母)以及细胞或组织裂解悬液样品的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)-辅酶Q 还原酶的特异性活性检测。其用于衰老、能量代谢、蛋白组学、病理生理学、神经病变等研究。产品不含污染性蛋白酶,严格无菌,即到即用,操作简捷,性能稳定,反应优化,检测敏感。 技术背景 线粒体呼吸链复合物I,通常称为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸辅酶Q还原酶(reduced nicotinamide adeninedinucleotide coenzyme Q reductase;NADH-CoQ reductase),又称为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶(reduced nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase;NADH dehydrogenase),是线粒体电子传递链中zui大的结构成分:含有30至40多个多肽结构。其特征性的酶活性是鱼藤酮敏感的NADH-辅酶Q还原酶(NADH:Q Reductase)。复合物I催化线粒体内电子由供体NADH传递到内膜上辅酶Q受体(泛醌;ubiquinone)的能量转移反应,为整个呼吸链反应系统的*步。基于辅酶Q底物,在鱼藤酮存在与否的情 况下,通过NADH-辅酶Q还原酶的催化,转化成还原型泛醌(CoQH2),同时还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(reduced nicotinamide adenine dinucleotide;NADH)转化为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamideadenine dinucleotide;NAD),在分光光度仪下产生吸收峰值的变化(340nm 波长),由此定量测定NADH-辅酶Q还原酶的特异活性。其反应系统是: 产品内容 缓冲液(Reagent A) | 毫升 | 反应液(Reagent B) | 毫升 | 阴性液(Reagent C) | 毫升 | 底物液(Reagent D) | 微升 | 专性液(Reagent E) | 微升 | 说明书 | 1 份 |
保存方式 保存在-20℃冰箱里,避免反复冻融;反应液(Reagent B)含有毒性物质,避免直接用手接触;反应液(ReagentB)和底物液(Reagent D),避免光照,有效保证6 月 用户自备 比色皿:用于比色分析的容器 双波长分光光度仪:用于比色分析 培养箱:用于孵育反应物 实验步骤 实验开始前,将-20℃冰箱里的试剂盒中的试剂溶液置入冰槽里融化;缓冲液(Reagent A)室温预热;反应液(Reagent B)和底物液(Reagent D)注意避光。然后进行下列操作。 一、测定准备 1. 准备好待测样品(例如纯化线粒体样品等),置于冰槽里(注意:检测前溶解线粒体;参见注意事项4) 2. 设定好双波长分光光度仪(温度为30℃):波长分别为340nm 和380nm,间隔30 秒,读数7 次(共3分钟),并置零(注意:参见注意事项10) 二、背景对照测定 1. 移取xx 微升缓冲液(Reagent A)到新的比色皿 2. 加入xx 微升反应液(Reagent B) 3. 加入xx 微升底物液(Reagent D) 4. 放进30℃培养箱里静置3 分钟 5. 加入xx 微升阴性液(Reagent C) 6. 上下倾倒数次,混匀(限定在3 秒之内) 7. 即刻放进分光光度仪检测,此为背景空对照: (340 波长读数-380 波长读数)0 分钟-(340 波长读数-380 波长读数)1 分钟或3 分钟 三、样品总活性测定 1. 移取xx 微升缓冲液(Reagent A)到新的比色皿 2. 加入xx 微升反应液(Reagent B) 3. 加入xx 微升底物液(Reagent D) 4. 放进30℃培养箱里静置3 分钟 5. 加入100 微升待测样品(注意:10 微克总线粒体蛋白;样品须溶解;参见注意事项4) 6. 上下倾倒数次,混匀(限定在3 秒之内) 7. 即刻放进分光光度仪检测,此为样品总活性读数: (340 波长读数-380 波长读数)0 分钟-(340 波长读数-380 波长读数)1 分钟或3 分钟 四、样品非特异活性测定 1. 移取xx 微升缓冲液(Reagent A)到新的比色皿 2. 加入xx 微升反应液(Reagent B) 3. 加入xx 微升专性液(Reagent E) 4. 加入xx 微升底物液(Reagent D) 5. 放进30℃培养箱里静置3 分钟 6. 加入100 微升待测样品(注意:10 微克总线粒体蛋白;样品须溶解;参见注意事项4) 7. 上下倾倒数次,混匀(限定在3 秒之内) 8. 即刻放进分光光度仪检测,此为样品非特异活性读数: (340 波长读数-380 波长读数)0 分钟-(340 波长读数-380 波长读数)1 分钟或3 分钟 五、计算样品活性 1)样品活性(总活性或非特异活性) 2)样品特异活性 注意事项 1. 本产品为30 次(15 个样本)操作,包括背景对照测定 2. 操作时,须戴手套 3. 系统操作过程中,背景测定只需1 次 4. 线粒体样品检测前,须溶解;建议冻存融解(-70℃至37℃)循环3 次或使用线粒体溶解试剂盒 5. 加入样品启动反应后3 秒内即刻比色测定 6. 通常反应1 分钟后比色测定值趋于稳定;测定值由高到低变化;测定可以持续3 分钟 7. 测定值由高到低变化,即3 分钟测定读数低于0 分钟测定读数,表明有酶活性 8. 比色测定后,比色皿须清洗* 9. 通常比色测定的OD340 起始读数0.5 为理想状态 10.如果用户没有双波长同步测定分光光度仪,可以使用单波长340nm 替代,注意活性计算时,毫摩尔吸光系数变成6.2 11.建议待测样本线粒体蛋白浓度为10 微克/100 微升;如果样本酶活性过低或过高,则可以增加或降低样本量;注意计算公式的调整 12.如果使用细胞或组织裂解悬液,则蛋白浓度为50 微克/100 微升 13.样品特异活性是指鱼藤酮敏感的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸-辅酶Q 还原酶,去除其它干扰因素(例如复合物II/III/IV 等) 14.线粒体呼吸链复合物I(NADH-辅酶Q 还原酶)单位活性定义为:在30℃,pH 7.5 条件下,每分钟内能够氧化1 微摩尔还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)所需的酶量作为一个活性单位 15.本公司提供系列线粒体及其酶类技术产品 质量标准 1. 本产品经鉴定性能稳定 2. 本产品经鉴定检测准确 |